聚合酶链式反应 (2).ppt

实时PCR技术原理QR3355上游引物下游引物荧光标记分子RQ3355荧光报告分子荧光淬灭分子荧光信号第96页,共107页，星期六，2024年，5月SYBRGreenI作用机理EmissionEmission第97页,共107页，星期六，2024年，5月SYBRGreenI作用机理ExcitationEmission第98页,共107页，星期六，2024年，5月原位PCR(InSituPCR,IS-PCR)是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内进行原位扩增目的片段,在不破坏细胞的前提下,利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物进行定性定量定位分析。即把原位杂交的细胞定位技术与PCR的高灵敏度相结合的技术。三、原位PCR第99页,共107页，星期六，2024年，5月▲待检标本先经化学固定，以保持组织细胞的良好形态结构。细胞膜和核膜均具有一定的通透性，PCR扩增时，各种成分，如引物，DNA聚合酶，dNTP等均可进入细胞内或细胞核内。▲以固定在细胞内或细胞核内的RNA或DNA为模板，于原位进行扩增。扩增的产物一般分子较大，或互相交织，不易穿过细胞膜或在膜内外弥散，被保留在原位。使原有的细胞内单拷贝或低拷贝的特定DNA或RNA序列在原位以呈指数扩增，扩增的产物就很容易被原位杂交技术检查。▲使用专用原位PCR的仪器。第100页,共107页，星期六，2024年，5月用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆,扩增基因文库的插入DNA；已知序列未知序列未知序列四、反向PCR第101页,共107页，星期六，2024年，5月已知序列未知序列未知序列限制酶限制酶连接酶未知序列已知序列第102页,共107页，星期六，2024年，5月不对称PCR用不等量的一对引物扩增后产生大量的单链DNA（ss-DNA）。这对引物分别称为非限制引物与限制性引物，其比例一般为50～100∶1。在PCR反应的最初10～15个循环中，其扩增产物主要是双链DNA，但当限制性引物(低浓度引物)消耗完后，非限制性引物(高浓度引物)引导的PCR就会产生大量的单链DNA。产生的ds-DNA与ss-DNA由于分子量不同可以在电泳中分开，而得到纯ss-DNA。主要为测序制备ss-DNA，为了制备探针。五、不对称PCR第103页,共107页，星期六，2024年，5月高浓度引物低浓度引物第104页,共107页，星期六，2024年，5月巢式PCR（nestedPCR），利用两套PCR引物对（巢式引物）进行两轮PCR扩增反应。第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，此产物在在内引物的存在下进行第二轮扩增。六、巢式PCR第105页,共107页，星期六，2024年，5月P1P2P3P4巢式PCR的使用降低了扩增多个靶位点的可能性，因为同多套引物都互补的靶序列很少。巢式PCR可以增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的灵敏度，并且提高了特异性。第106页,共107页，星期六，2024年，5月感谢大家观看第107页,共107页，星期六，2024年，5月A正常人病人正常病人第64页,共107页，星期六，2024年，5月ASO探针法病人ACTGASO探针正常PCR-ASO检测基因点突变：主是利用PCR技术扩增靶基因的适当片段，然后用人工合成的含突变位点的标记寡核苷酸探针杂交第65页,共107页，星期六，2024年，5月探针杂交NC膜探针正常人突变纯合子突变杂合子第66页,共107页，星期六，2024年，5月PCR-RFLP（restrictionfragmentlengthpolymorphism限制性片段长度多态体）法：限制性核酸内切酶恶性肿瘤（癌基因或抑癌基因）Ras基因第67页,共107页，星期六，2024年，5月突变限制性核酸内切酶第68页,共107页，星期六，2024年，5月正常突变电泳第69页,共107页，星期六，2024年，5月3.DNA和RNA的微量分析PCR技术高度敏感，对模板DNA的量要求很低，是DNA和RNA微量分析的最好方法。第70页,共107页，星期六，2024年，5月PCR后将待测DNA片段既可克隆到特定的载体进行序列测定，可直接测定。PCR技术引入DNA序列测定，使测序工作大为简化，也提高了测序的速度；使用引物