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小鼠肺泡巨噬细胞的分离与培养

巨噬细胞通常有两个不同的亚群：经典激活M1型，具有促炎作用。可被

LPS单独或与Th1细胞因子(如IFN-γ，GM-CSF)联合极化，并产生促炎细胞因

子，IL-1β、IL-6、IL-12、IL-23和TNF-α；第二种是交替激活M2型巨噬细

胞，具有抗炎和免疫调节作用，被Th2细胞因子IL-4和IL-13极化，产生IL-

10和TGF-β等抗炎细胞因子。

目前实验常用的细胞系有RAW264.7，THP-1以及原代BMDM细胞等，而

肺泡巨噬细胞(Alveolarmacrophages,AM)比较少用但研究很有必要。

AM是肺的常驻组织巨噬细胞，在出生前后定植于肺部，在成年生物体中无

需单核细胞的贡献即可长期自我维持，对免疫调节和表面活性剂稳态至关重

要。由于AM定位于肺泡的空气空间，所以直接暴露于吸入的空气和病原体或

其他雾化颗粒中。我们可以通过支气管肺泡灌洗法(BAL)清洗肺部收集。

一、方法：通过支气管肺泡灌洗(BAL)获取肺泡巨噬细胞。

1.为每只老鼠准备一个15mL的锥形管，管内装有3mL完整的培养基。

2.将BAL缓冲液(PBS+EDTA)在水浴中加热至37°C，在整个过程中要注意

保持温度。

3.在不破坏颈静脉或气管的情况下，采用颈椎脱位法对小鼠实施安乐死，避

免AM暴露于CO2或异氟醚中，影响AM的功能特性。

4.使用解剖工具，切除皮肤、胸腔和肌肉，露出肺和气管，避免割伤或破

裂血管。

5.用一把细剪刀在喉头下方的气管上部做一个小切口，气管朝下的部分(远

离实验者)应保持完整，不要切开整个气管。

6.使用切口插入一根稍钝的18-G套管，将套管插入气管向肺方向深

5mm，注意不要损伤肺组织。

7.将1mL注射器吸取1mL温热BAL缓冲液连接到插入的套管上。

8.注射缓冲液1mL，另一只手固定套管位置。

9.拉动柱塞收集注射器中的BAL液。回收率约为800~900μL。注意气压

不宜过高，否则肺泡破裂，BAL液流失。注射和收集后，肺部应明显充盈和收

缩。

10.通过70μm细胞过滤器将收集的BAL液过滤到步骤1中含有3mL完

整培养基的15mL管中。

11.使用新鲜的温BAL缓冲液，重复步骤6-10大概9次以上。将细胞倒入

相同的15mL管中。

12.收集细胞，在300g,4°C，离心5min，去除上清，细胞颗粒应为白色，

红色/粉红色表示在BAL过程中意外采集了血液。

13.加入1mL裂红液，室温孵育2min，溶解残余红细胞。试管中加入适量

完全培养基，停止裂解，离心收集细胞，去上清，现在细胞颗粒的颜色应该是

白色的。

14.将细胞颗粒重悬于500μlBAL缓冲液中，台盼蓝染色排除死细胞后取

标本计数。仅计数活细胞(台盼蓝阴性)。

15.计算每个BAL的总单元数。通常情况下，每只6-8周龄成年野生型小

鼠使用含有2mMEDTA和0.5%血清的PBS预热BAL缓冲液可回收5×10^5-7

个活细胞。

16.进行细胞染色和流式细胞术分析或体外培养。

二、流式分析肺泡巨噬细胞

1.用trustainfcx阻断细胞上的非特异性结合位点，同时用僵尸紫染色，在

200μL预冷PBS(不含FBS)中，4°C，黑暗中染色15min(见表2)。

2.用预冷BAL缓冲液300g在4°C下离心5min洗涤细胞。

3.根据表格，以100μL/100万个细胞的体积对细胞进行染色，在4°C的黑

暗中使用BAL缓冲液染色30min。

4.每个荧光抗体制备单染管用作补偿调节。

5.用BAL缓冲液洗涤细胞，重悬于200μLBAL缓冲液中记录。

6.AM对SiglecF和CD11c呈双阳性，且存活率活性高达98%。

三、肺泡巨噬细胞的培养：

1.像前面一样离心，去上清，收集细胞。

2.未处理的6孔板每孔按3×10^5-4×10^5个细胞，用3mL预热的AM培

养基培养。如果是在94mm培养皿中培养，则细胞密度调整为110-120万个细

胞，培养基10mL。

3.在AM