《细粒棘球绦虫快速检测方法crispr-cas12a》.docxVIP

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西藏自治区地方标准

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发布西藏自治区市场监督管理局20XX-XX-XX实施20XX-XX-XX发布细粒棘球绦虫快速检测方法crispr-cas12a（征求意见稿）DB54/TXXXX-XXXX

发布

西藏自治区市场监督管理局

20XX-XX-XX实施

20XX-XX-XX发布

细粒棘球绦虫快速检测方法crispr-cas12a

（征求意见稿）

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前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

本文件由西藏自治区农业农村标准技术委员会提出并归口。

本文件起草单位：西藏自治区农牧科学院畜牧兽医研究所。

本文件主要起草人：唐文强、黄福强、石斌、李鑫、赵霞玲、夏晨阳、单曲拉姆、马弘财、刘增强、齐婉香、罗润波、孙建春。

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细粒棘球绦虫快速检测方法：CRISPR-Cas12a

范围

本文件规定了细粒棘球绦虫CRISPR-Cas12a检测的术语和定义、仪器耗材与试剂、操作方法及结果判定等要求。

本文件适用于实验室对细粒棘球绦虫的快速检测。

规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB19489实验室生物安全通用要求。

术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

CRISPR-Cas12a

CRISPR全称为ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats，中文翻译为“成簇的规律间隔短回文重复序列”，是细菌的适应性免疫系统。Cas全称为CRISPRassociatednuclease，指CRISPR相关核酸酶，Cas12a效应蛋白又称为Cpf1效应蛋白，是一种由可编程RNA引导的DNA核酸酶，属于Ⅱ类V型CRISPR/Cas系统。

细粒棘球绦虫

一种在世界范围内流行的人畜共患慢性寄生虫，属圆叶目（Cyclophyllidea）带科（Taeniidae）棘球属（Echinococcus）绦虫，可引起囊型棘球蚴病（cysticechinococcosis,CE）。

仪器材料与试剂

仪器

a) 实时荧光恒温扩增仪、金属浴、恒温培养箱等任意一种可以恒温在37℃的仪器；

b)微量移液器（1μL~10μL，20μL~200μL，200μL~1000μL）；

c)掌上离心机：最高转速不小于8000rpm；

d)冷冻式离心机：最高转速不小于15000rpm；

e)涡旋震荡仪；

f)-80°超低温冰箱；

g)实时荧光恒温扩增仪、荧光定量PCR仪、蓝光照胶仪、验钞灯等任意一种可以实时检测荧光信号或可发出蓝/紫光的仪器设备。

材料

a)0.2mL透明顶盖PCR反应管；

b)离心管（1.5mL）；

c)一次性移液器吸头；

d)冰盒；

试剂

粪便基因组DNA提取试剂盒，LbCas12a核酸酶，反应缓冲液CleavageBuffer，荧光探针reporter，RPA试剂盒，阴性质控：ddH2O，阳性质控：含有目标核酸片段（附录A）的质粒制品，crRNA及RPA引物序列及配制的母液浓度见附录B。

操作方法

生物安全措施

检测过程中的个人防护及废弃物处置应按照GB19849的规定处理。

样品采集和处理

a)采集含细粒棘球绦虫组织的病料、细粒棘球绦虫组织/虫卵污染的环境样本或新鲜犬粪200~500mg，放入1.5mL离心管中，冷藏运至实验室，-80℃保存,待提取DNA；

b)含细粒棘球绦虫成虫或虫卵的样品提取DNA前应先放置于-80℃超低温冰箱冷冻不少于7天，以灭活病原；

c)使用通用型基因组DNA提取试剂盒提取含棘球绦虫/蚴组织样本全基因组，使用粪便基因组DNA提取试剂盒提取含棘球绦虫成虫或虫卵的粪便样品全基因组；

d) 提取好的全基因组置于4℃保存，若不能当天检测，应放于冰箱冷冻室-20℃保存。

检测前准备

将所用恒温设备调至37℃预热。若为实时荧光恒温扩增仪或荧光定量PCR仪，将其扩增温度设置为37℃，扩增时间为30min，且每分钟读取一次荧光。

CRISPR/Cas12a方法检测核酸

a) 将CRISPR/Cas12a酶、反应缓冲液CleavageBuffer和荧光探针reporte