肽结合力与稳定性实验相关知识.docx

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课题背景学问：

8细胞免疫应答中起重要作用。8()对靶细胞发挥杀伤作用，必需能识别靶细胞外表及相应类分子结合的特异性抗原表位，即表位。课题组已经根据抗原的一级构造，承受免疫信息学手段，对蛋白抗原的＊2/3限制性表位进展了意料分析，初步选择到表位。通过T2细胞结合力以及稳定性试验，对初步选择的表位进展验证，获得及分子具有高结合力的表位，用于后续体外免疫活性检测。

T2细胞结合力试验相关文献

〔一〕理论学问

1什么是T2细胞T2细胞是内源性抗原提呈途径中必需的抗原多肽转运蛋白()缺陷的细胞株$2084633[1]，为2阳性的T,B淋巴细胞杂交瘤细胞，可用于探讨抗原递呈过程和T细胞及分子的互相识别$2084616[2]。

2为什么要做结合力试验类分子及表位的有效结合是特异性细胞免疫应答的一个重要环节。因为个体内仅存在少数几个型别的类分子，由于每个类分子可及一系列同种类的抗原肽结合.进而形成多种多样的肽复合物，这样就使机体免疫系统可以针对众多抗原发生特异性的免疫应答。另外，在细胞外游离肽浓度近乎为零的环境中，类分子还必需使相应的抗原肽在细胞外表保存足够长的时间，实现特异性8+T细胞对它的识别。有文献报道$2086111[1]绝大多数表位以高或中等亲和力及类分子有效结合。

3什么是T2细胞结合力试验由于T2其自身不能提呈抗原肽到类分子上，所以T2细胞外表空载的2分子表达极不稳定，表达后很快降解。但当有外源性抗原肽及之结合后，2的表达就被稳定。抗原肽及2的结合力越强，则T2细胞外表2分子的降解就越少，表现为表达量越高。T2外表2分子表达量的增加直观地反映了外来抗原肽及2的结合力$2088562[1]。

4怎么设计候选表位肽T2细胞的结合力试验〔1〕阳性比照，文献中报道的大家公认的及T2细胞有强的结合力的多肽；〔2〕阴性比照，单纯的；〔3〕背景比照，不用多肽冲击的T2细胞；〔4〕肽及T2细胞的结合力的断定根据：A、浓度比照法来表示待测肽及的相对亲和力()。诱导表达20%的待测肽的浓度/诱导表达20%的阳性肽的浓度，值越小，肽及的亲和力越强$2098378[3-4]。B、间接免疫荧光法检测各肽及分子的结合状况。外源性多肽及T2细胞外表I类分子的结合可使其外表I类分子的表达量增加，两者结合越稳固，可检测到的I类分子越多，最终以平均荧光强度为检测指标，以荧光系数〔〕作为衡量指标$2097310[1-2,5]。尽管不同的文献报道的的算法略有差异。

〔二〕详细试验方法

1()*0201.

〔1〕,T2*0201.,*0201100μM589().20%*0201$2091082[4]。

〔2〕T2(3x105)1000.1μM1640100β2m37°C16h.7.2,*0201.,*0201100μM589().():20%*020120%*0201.$2092487[3]。

2间接免疫荧光法检测各肽及分子的结合状况

〔1〕首先将1x106的T2细胞用冰、800离心6，洗涤3次后，再及10μ的候选肽37共孵育4h。孵育好的细胞用冰，同样离心条件洗涤3次，参与100μl7.2杂交瘤细胞培育上清液，冰浴40。洗涤3次，参与100μl1:100稀释的二抗标记的羊抗鼠溶液，在冰上孵育40，洗涤后于流式细胞仪检测平均荧光强度，波长488。阳性肽2112-120作为阳性比照，未加肽刺激的单纯T2细胞为背景比照。荧光系数〔〕=(样本平均荧光强度-背景平均荧光强度)/背景平均荧光强度$2095492[5]。

〔2〕首先将1x106个T2细胞用冰,800离心6,洗涤3次后,再及10?待测肽37共孵育4h.孵育好的细胞用冰,同样离心条件洗涤3次,参与100?L7.2杂交瘤细胞培育上清液,冰浴40.洗涤3次后,参与100?L稀释度为1:100的羊抗鼠溶液,在冰上孵育40,洗涤后于流式细胞仪()检测平均荧光强度,波长488.以单纯的T2细胞加二抗为阴性比照,T2细胞加一二抗为背景比照。荧光系数()=〔样品平均荧光强度-背景平均荧光强度〕/〔T2细胞荧光强度-背景荧光强度)×100$2099238[2]。