实验五-SDS-PAGE检测微生物有机磷降解酶的诱导表达.docVIP

实验五SDS检测微生物有机磷降解酶的诱导表达

实验目的：

1．观察重组表达蛋白在IPTG诱导下的表达过程

2．掌握蛋白质的SDS电泳原理和实验技术

实验材料：

1．材料30%丙烯酰胺溶液，1.5mol/LTris-HCl（pH8.8)，10%SDS，10%过硫酸铵，1.0mol/LTris-HCl(pH6.8),5×蛋白质电泳缓冲液，考马斯亮蓝染色液，脱色液，lmol/L的IPTG溶液，2×上样缓冲液，蛋白质分子量标样。

2．仪器电泳仪，垂直电泳槽，超声波破碎仪，高速低温冷冻离心机。

实验原理:表达产物可以通过SDS电泳来分析检测，蛋白质与SDS结合后形成带有大量负电荷的椭球形结构，所有的蛋白质均带有大量负电荷（可以忽略不同蛋白质间荷电数的差异），在电场作用下按相对分子量大小在板状胶上排列。通过SDS检测可以发现外源蛋白随诱导时间的增加表达量增加，条带浓度加深。

目前在蛋白质电泳中最广泛使用的是不连续缓冲系统，SDS聚丙烯酰胺凝胶大多按双丙烯酰胺：丙烯酰胺为1：29配制，它能分离大小相差只有3%的多肽。

凝胶的筛分特性取决于它的孔径，而孔径又是灌胶时所使用丙烯酰胺和双丙烯酰胺绝对浓度的函数。

实验内容：

1．微生物有机磷降解酶在大肠埃希菌中的诱导表达

从LB（含50mg/mL卡那霉素）平板上挑取E.coliBL21（DE3）/pET28-yjl单菌落于50mLLB培养基中，37℃、200r/min振荡培养过夜。按2%接种量接种至1.2L新鲜LB培养基，37℃培养约2.5h后，OD600增至约0.6，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，继续培养4h，每隔30min取10mL培养液，4℃、6000r/min

2．菌体破碎收集的菌体重悬于lmLTE(pH8.0)缓冲液中，进行超声波破碎，破碎时间6min，30s脉冲，30s间歇，菌体裂解液4℃10000g离心10min，取上清液进行PAGE

3．SDS聚丙烯酰胺凝胶制备与电泳

确定所需凝胶溶液体积，在三角瓶中配制浓度10%的丙烯酰胺分离胶溶液，依次混合各成分。一旦加入TEMED，马上开始聚合，故应立即快速旋动混合物并进入下一步操作。

迅速在两玻璃板的间隙中灌注丙烯酰胺溶液，留出灌注积层胶所需空间（梳子的齿长再加lcm)。用巴斯德吸管小心地在丙烯酰胺溶液上覆盖一层0.1%SDS。将凝胶垂直放置于室温下。

分离胶聚合完全后(30min），倾出覆盖层液体，用去离子水洗涤凝胶顶部数次以除去未聚合的丙烯酰胺。尽可能排去凝胶上的液体，再用纸巾的边缘吸尽残留液体。

在一个一次性塑料试管中制备3mL浓度5%的丙烯酰胺溶液，依次混合各成分。一旦加入TEMED，立即快速旋动混合物并进入下一步操作。

在已聚合的分离胶上直接灌注积层胶，立即在积层胶溶液中插入干净的Teflon梳子。小心避免混入气泡，再加入积层胶溶液以充满梳子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室温下。

当积层胶发生聚合时，把样品置于1×SDS凝胶加样缓冲液中，在100℃加热3min

积层胶聚合完全后（30min)，小心移出Teflon梳子，使用能喷射水流的瓶子，立即用去离子水洗涤加样槽以除去未聚合的丙烯酰胺。使用接于注射器的平头注射针头把积层胶上加样槽之间的齿弄直。把凝胶固定于电泳装置上，上、下槽各加入Tris-甘氨酸电泳缓冲液。必须设法排出凝胶底部两玻璃板之间的气泡，为此最好使用接上注射器的弯形注射针头。

按预定顺序加样，每样品加15ml。最后在所有不用的样品孔中加上等体积的1×

将电泳装置与电源相接（正极应接下槽），凝胶上所加电压为8V/cm。当染料前沿进入分离胶后，把电压提高到15V/cm，继续电泳直至澳酚蓝到达分离胶底部（约需4h)，然后关闭电源。从电泳装置上卸下玻璃板，放在纸巾上，用刮勺撬开玻璃板。

4．用考马斯亮蓝对SDS来丙烯酰胺凝胶进行染色

在90mL甲醇：水（1:1，V/V）和10mL冰乙酸的混合液中溶解0.25g考马斯亮蓝8250.用Whatman1号滤纸过滤染液以去除颗粒状物质。

用至少5倍体积的染液浸泡凝胶，放在平缓摇动的平台上于室温染色4h以上。

移出并回收染液以备后用，将凝胶浸泡于不加染料的甲醇一乙酸溶液中，

平缓摇动4~8h，其间应更换脱色液三四次。

脱色后，可将凝胶浸于水中，拍照。