稳定表达核仁素的H9C2细胞株的建立和鉴定 .pdfVIP

目的：建立稳定表达核仁素的H9C2大鼠心肌细胞株,为进一步研究核仁素在心肌细胞凋亡

中的作用提供细胞模型。方法：将含有核仁素全长的质粒pCMV-Tag2B-Nuc用脂质体转染

技术导入H9C2细胞，使核仁素在细胞内表达，用G418筛选出稳定表达核仁素的细胞株；

用双酶切、DNA测序鉴定质粒，用RT-PCR及Westernblot检测核仁素基因在靶细胞中的

整合与表达。结果：经G418反复筛选的H9C2细胞株中，核仁素基因在mRNA及蛋白质水

平表达均较野生型细胞及转空载体细胞升高。结论：用含核仁素全长的质粒转染H9C2大鼠

心肌细胞，经筛选后可稳定表达核仁素。

【关键词】核仁素；H9C2细胞；基因转染

AbstractObjective:ToestablishH9C2celllinethatcanstablyexpressthenucleolin,whi

chcanprovideacelllinewithwhichwecananalyzethefunctionofnucleolininapopto

sisofcardiomyocytes.Methods:ThepCMV-Tag2B-NucplasmidwastransfectedintoH9C2

cellswithlipofectin,thestabletransfectantsscreenedbyG418andtheexpressionofnucleo

linwasidentifiedandanalyzedbyRT-PCRandWesternblot.ThepCMV-Tag2B-Nucplas

midwasconfirmedbydouble-enzymedigestionandsequencing.Results:AfterG418screeni

ng,comparedwiththecontrolgroup,themRNAandproteinofnucleolinintransfectedcel

llinewerehighlyexpressed,asdemonstratedbytheRT-PCRandWesternblotanalysis.C

onclusion:TheratH9C2celllinestablyexpressingnucleolinwassuccessfullyconstructed.

KeywordsNucleolin;H9C2cellline;Genetransfection

近年来的研究表明，越来越多的心血管疾病发生发展与细胞增殖和凋亡有关。细胞凋亡

的发生机制十分复杂，至今仍未完全阐明。核仁素（又称C23）是真核细胞核仁中最主要的

一种蛋白质，具有多种生物学功能，它不但直接参与核糖体的生物合成与成熟，还直接或间

接参与细胞增殖、生长、胚胎发生、胞质分裂、染色质复制与核仁的发生等过程［１］。另

有研究表明，核仁素蛋白的断裂和转位改变与细胞凋亡的发生相关［２，3］。因此，本研

究拟建立能够稳定表达核仁素的H9C2大鼠心肌细胞，为研究核仁素在心肌细胞凋亡中的作

用提供理想的细胞模型。

1材料与方法

1.1材料

质粒pCMV-Tag2B-Nuc由德国Hamburg-Eppe大学细胞生物化学与临床神经生物学研究

所StefanKindler教授惠赠；H9C2细胞株由中南大学细胞中心提供；DMEM培养基，Gibc

o公司产；辣根过氧化物酶（HRP）标记的兔抗鼠或羊抗兔或羊抗小鼠IgG，Sigma公司产；

无支原体胎牛血清，杭州四季清生物工程公司产；LipofectamineTM2000转染试剂盒，Invit

rogenlifetechnologies公司产。鼠抗C23单克隆抗体，SantaCruz公司产；质粒抽提试剂盒，

大连TaKaRa公司产；DAB显色试剂盒，武汉博士德生物技术公司产；Trizol试剂，Gibco

BRL公司产。

1.2.H9C2细胞培养

大鼠心肌细胞株（H9C2）用含10%胎牛血清的DMEM培养基，细胞于37℃，5%CO2

条件下培养，待细胞生长至约85%的融合状态用于实验。

3质粒扩增、抽提及鉴定

质粒转化感受态细