酶免疫技术（免疫学检验课件）.pptx

酶免疫技术;酶免疫技术：以酶标记的抗体或抗原作为

主要试剂，将抗原抗体反应的特异性和酶

催化底物反应的高效性和专一性相结合的一种免疫检测技术。;基本原理;;酶免疫技术的分类;一、常用的酶及底物;

1.辣根过氧化物酶(HRP)

糖蛋白(主酶)+亚铁血红素(辅基)

;邻苯二胺OPD;OPD（邻苯二胺）反应后显橙黄色，加酸终止反应后呈棕黄色，测定波长492nm。不稳定，有致癌性。;是一种磷酸酯水解酶，从大肠杆菌提取;源于大肠埃希菌，常用于均相酶免疫测定。;在商品试剂中，经常应用的酶还有葡萄糖氧化酶(GOD)、6-磷酸葡萄糖脱氢酶、溶菌酶、青霉素酶、脲酶、苹果酸脱氢酶等。;二、制备酶标记抗体(抗原)的方法;（一)戊二醛交联法;（二)改良过碘酸钠法;三、酶标记物的纯化与鉴定;2.酶标记物的鉴定;四、固相载体;（二）固相载体的种类;微量反应板;酶联免疫吸附试验（ELISA）三大必备试剂：酶标志物、酶对应的底物、固相载体;酶联免疫吸附试验;酶联免疫吸附试验（ELISA）;二、ELISA的方法类型（六种）;;（1）将特异性抗体包被于固相反应板上，洗涤。

（2）加待检标本,温育，洗涤。

（3）加酶标抗体，洗涤。

（4）加底物，根据颜色反应的程度进行该抗原的

定性或定量。;;双抗体夹心法中，应注意类风湿因子(RF)的干扰。如果待检标本中含有RF，可能产生假阳性结果。使用抗体的F(ab’)2或Fab片段作为酶标抗体可消除RF的干扰。;（二）双位点一步法检测抗原;;

;如果待检标本中抗原浓度过高，容易形成“钩状效应（hookeffect）”。钩状效应严重时，可出现假阴性结果，必要时可将待检标本适当稀释后重新测定。;（三）间接法检测抗体;;（1）将特异性抗原包被于固相反应板上，洗涤。

（2）加稀释的受检血清，洗涤。

（3）加酶标二抗，洗涤。

（4）加底物显色，颜色深度代表标本中待检抗体

的量。;

;由于此法易受血清中高浓度非特异性IgG的干扰，通常要将待测标本进行一定稀释后才能测定。;（四）竞争法;酶标抗原;（1）将特异性抗体包被于固相反应板上，洗涤。

（2）待测管中加待检标本和一定量酶标抗原的混合溶液，???检标本中如果含有抗原，则与酶标抗原竞争固结合相抗体，使酶标抗原与固相载体的结合量减少。对照管中只加酶标抗原，温育，洗涤。

（3）加底物显色。对照管中颜色深，待测管颜色越淡，表示标本中抗原含量越多。;

;抗体的测定一般不使用竞争法。当抗原杂质难以去除，不易得到足够的纯化抗原或抗原的性质不稳定时，可采用这种方法测定抗体。如HBcAb和HBeAb的检测，由于e抗原较核心抗原仅多29个氨基酸，e抗原很容易转变为核心抗原，因此HBcAb和HBeAb的测定均采用竞争法，但模式有所不同。;（1）竞争法检测HBcAb：

①将HBcAg包被于固相反应板上，洗涤。

②加入待检标本和酶标特异性抗体，温育，洗涤。

③加入底物，温育，形成有色产物，用酶标比色仪测定结果。显色深浅与待检标本中相应抗体含量成反比。;;3.加酶作用的底物

显色;（2）竞争法检测HBeAb：

①将HBeAb包被于固相反应板上，洗涤。

②加入待检标本和HBeAg，温育，洗涤。

③加入酶标HBeAb，温育，洗涤。

④加入底物，温育，形成有色产物，用酶标比色仪测定结果。显色深浅与待检标本中相应抗体含量成反比。;;;（五）捕获法检测IgM抗体;（1）将抗人IgMμ链抗体包被于固相反应板上，

洗涤。

（2）加人待检标本，温育，洗涤。

（3）加入特异性抗原，温育，洗涤。

（4）加入抗原特异的酶标抗体，温育，洗涤。

（5）加入底物，温育一定时间，显色，用酶标

比色仪测定结果。;;5.加酶作用的底物

不显色;采用固相捕获法检测IgM类抗体时要注意的是RF（IgM类）及其它非特异IgM的干扰。RF（IgM类）能与固相抗人μ链抗体结合，并可与随后加入的酶标抗体（动物IgG）反应，从而导致假阳性反应。

;非特异IgM由于其在第一步温育中，可与特异IgM竞争与固相抗体结合，所以会影响测定的灵敏度。因此，使用本法测IgM，必须对临床样本进行适当稀释。

;（六）双抗原夹心法检测抗体;;4.加酶作用的底物

不显色;ELISA的技术要点包括三个方面：反应所需各种试剂的制备、反应条件的选择和操作的标准化。;酶标记的抗原和抗体

固相的抗原或抗体

标记酶作用的底物;（二）最适工作浓度的选择;（1）用包被液将抗原作一系列稀释后包被，洗涤。

（2）将强阳性参考血清、弱阳性参考血清和阴性参考血清用稀释液作1:100稀释，加样，温育，洗