Geneengineering基因工程重点.pdf

Geneengineering基基因因⼯⼯程程重重点点

基因⼯程

第⼆章基本技术

1.琼脂糖凝胶电泳Agarosegelelectrophoresis

原理：DNA带的负电荷数、DNA的分⼦质、凝胶浓度、缓冲液成分的不同导致了DNA电泳移动的多态性。

PFGE:脉冲电场凝胶电泳Pulsedfieldgelelectrophoresis

CHEF：曲线夹均匀电场电泳Contour-clampedhomogeneouselectrical-fieldelectrophoresis

凝胶中DNA的检测：溴化⼄腚染⾊（E）、银染、花青素染⾊

应⽤：DNA分析、DNA准备、DNA-蛋⽩质相互作⽤凝胶阻滞分析、DNase1⾜迹分析

2.⼏种印记

Southernblot(DNA印迹）：酶切的DNA⽚段经过琼脂糖凝胶电泳分离，碱变性后转移到固相⽀持物（NC膜）上，⽤标记的

探针检出⽬的⽚段所在位置的⽅法。

Northernblottting(RNA印迹)：不同分⼦的RNA经过变性琼脂糖凝胶电泳分离，转移到固相⽀持物上，⽤特异探针检出⽬的

RNA所在位置的⽅法。

Westernlotting(蛋⽩质印迹,免疫印迹):不同分⼦的蛋⽩质经SDS分离，转移到固相⽀持物上，⽤特异的抗体检出⽬

的蛋⽩所在位置的⽅法。

3.⼤肠杆菌的转化

DNA

⽅法：⽤CaCl2处理的⼤肠杆菌可以吸收外源

影响转化的因素：

●⼤肠杆菌的类型（ThetransformationefficiencyforE.coli(recC+)isonly10%ofthat(recC-)）、

●限制系统（外源DNA的识别和降解）、

●⾦属离⼦（Ca2+,Mn2+能加速转化）、

●环境条件（低温、热激）

4.电穿孔Electroporation

原理：⾼压电击能导致细胞膜形成微孔，⽤这种⽅法处理的细胞能从溶液中吸收外源DNA。

影响电穿孔效率的因素：A温度、电场限制因素（V,R,C）、C外源DNA的拓扑构象、D宿主细胞的因素（遗传背景、⽣长条

件、脉冲处理）

5.常⽤的⼏种转化⽅法：A原⽣质体转化、脂质体和宿主细胞脂膜的融合、C电穿孔、D通过植物细菌或病毒转

化(农杆菌)、E⽤CaCl2处理

6.PolymeraseChainReaction(PCR)

反应体系：1.Template:DNA2.Primers(2)3.dNTP(dATP,dTTP,dCTP,dGTP)4.TaqDNApolymerase

5.uffer

过程：A变性94℃,0.5min、引物退⽕55℃,1.5min、C延伸72℃,1min25-35cycles

注意：TaqDNApolymerase缺少3’to5’外切酶活性（校正活性）

影响PCR的主要因素

●引物——理想的引物应该：A长度为17~30个核苷酸；.GC含约为50%；C避免串联重复序列；

D⽆明显的⼆级结构；

E两个引物之间不互补

●热启动⽅案——DNA聚合酶应该在第⼀次热处理之后加⼊，以避免形成错配的引物-模板复合体；

热启动⽅案的⼀个替代⽅案是：⼀开始就向反应体系中加⼊TaqDNApolymerase的抗体。

●嵌套引物——⽤第⼀个循环扩增出的DNA作为模板，以避免引物对模板的⾮特定位点的错配。

7.RT-PCR：反转录PCR——起始模板为RNA

8.LongaccuratePCR(LA-PCR)：长链精确PCR——向反应体系中加⼊有校正能⼒的热稳定性聚合酶（⾼保真）

9.Real-timequantitativePCR：实时定PCR

Real-time——可以随时检测产物e.g.1,2,3…cycles

反应体系：向体系中加⼊⼀个5’端有报告荧光染料标记并且3’端有淬灭燃料标记的探针，在完整的引物中没有荧光发射。如果

探针的5’端被TaqDNA聚合酶被降解，荧光染料被释放，⼀个荧光信号就会被检测到。信号的强度与被扩增的⽬的DNA数

呈正⽐。

第三章DNA分⼦的切割

1.R-M（restrictionandmodification切割和修饰）系统的类型——四种内切酶（选择题）

typeI：切割、修饰是同⼀个酶，该酶有不同的亚基来执⾏识别、切割、甲基化，识别和甲基化的序列是相同的单⼀序列，在

1000bp以外进⾏切割。

typeII：切割、修饰是在两个不同的酶上，这两个酶都识别相同的靶序列，⽽且这两个序列是对称的。

typ