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实验报告
题目:单元三:重组DNA在大肠杆菌中的诱导表达
指导老师:邓庆丽
日期:2013/10/31-201311/1
一.实验目的:
(1)了解和掌握IPTG诱导表达的原理和操作方法。
(2)了解降解物阻遏的现象及其机理。
二.实验原理:
本实验使用的是载体是已重组好的pGFPuv,宿主细胞为大肠杆菌,目的基因的产物为
融合蛋白,目的蛋白为绿色荧光蛋白GFP,非目的蛋白即融合部分为标签6×His,用于单元
四的亲和层析分析。
本实验采用的启动子为可调控的强启动子乳糖操纵子lac。
操纵子是原核基因表达的协调单位。通常由2个以上功能相关的结构基因以及一些调节
序列(如启动子序列、操纵序列等)组成。乳糖操纵子由三个结构基因Z、Y、A和操纵序
列、启动子、CAP结合位点等调节序列组成,如下图1所示:
乳糖操纵子的调节包括诱导效应和降解物阻遏效应。
(1)诱导表达
当没有乳糖存在时,调节基因lacI表达,转录的mRNA翻译成阻遏蛋白。阻遏蛋白与
操纵序列lacO结合,阻碍了结合在旁边启动子的RNA聚合酶向前移动,使目的基因(本实
验中的绿色荧光蛋白基因GFP)不能转录,也就不能翻译出蛋白质。也就是说,当没有乳糖
存在时,乳糖操纵子处于阻碍状态,如下图2所示:
当有乳糖存在时,乳糖转化为异乳糖,异乳糖作为诱导物与阻遏蛋白结合,使阻遏蛋白
的构象发生改变,而不能结合到操纵序列上,RNA聚合酶可以从启动子向3’端移动,于
是,结构基因可以转录出mRNA,然后翻译出蛋白质。也就是说,当有乳糖存在时,乳糖
操纵子被诱导,如下图3所示:
乳糖操纵子的诱导物是异乳糖。IPTG是异乳糖的结构类似物。由于IPTG不会被分解,
它的诱导作用是持久的。
(2)葡萄糖降解物的阻遏作用
代谢物基因激活蛋白(CatabolitegeneActivationProtein)CAP,又称cAMP受体蛋白属
于激活蛋白的一种,对乳糖操纵子进行正调节。CAP分子内分别有DNA结合区和cAMP
结合区。当CAP与cAMP结合后,就可结合DNA促进乳糖操纵子的转录。
葡萄糖降解物能抑制腺苷酸环化酶的活性,并活化磷酸二酯酶的活性,从而降低cAMP
的浓度,抑制乳糖操纵子的转录。
本实验使用的表达载体pGFPuv上含有乳糖操纵子的调节序列,目的基因表达的是带6
5
×His的重组绿色荧光蛋白。在IPTG的诱导下,融合蛋白表达可增强10倍,并且可用金
属螯合亲和层析分离纯化,最终获得纯的重组绿色荧光蛋白。
三.材料与试剂:
(1)材料
工程菌:BL21(DE3)p32a、BL21(DE3)pGFPuv
(2)试剂
LB液体培养基:蛋白胨(tryptone)10g、酵母粉(yeastextract)5g、NaCl10g,加
800mL双蒸水溶解,用10MNaOH调pH至7.2-7.5,定容至1000mL。
分装,高压灭菌,4℃保存。
氨苄青霉素溶液:无菌双蒸水配成100mg/mL,分装,-20℃保存,使用终浓度为50μ
g/mL或100μg/mL。
IPTG溶液(100mM):将238.3mgIPTG溶解于10mL双蒸水,0.22μm细菌滤器过滤
除菌,分装,-20℃保存备用,贮存浓度为100mM。
20%葡萄糖溶液
超声平衡缓冲液:50mMTris-HCl,500mMNaClpH7.0
四.实验仪器:
超净工作台、低温摇床、高速冷冻离心机、超声破碎仪等。
五.实验步骤、现象、结果及分析:
1.工程菌的活化(10月30号教师准备)晚上7点接
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