美洲黑杨性别早期鉴定的微卫星分子标记技术规程.docxVIP

1

T/JSFXXXX—2XXX

美洲黑杨性别早期鉴定的微卫星分子标记技术规范

1范围

本标准规定了以美洲黑杨(Populusdeltoides)幼嫩组织（叶片、芽等）为材料，利用分子标记法对美

洲黑杨性别进行分子鉴定的术语、原理、主要仪器和设备、试剂与溶液、操作程序和鉴定。

2规范性引用文件

本文件没有规范性引用文件。

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件

3.1分子标记MolecularMarkers

指以直接检测DNA核苷酸序列的差异为基础的遗传标记。

3.2微卫星microsatellite

简单重复序列simplesequencerepeats；SSR

也称基因组中由2个～6个核苷酸组成的DNA串联重复序列。

3.3性别鉴定sexdiscrimination

指对雌雄异株植物通过分子标记技术鉴定性染色体确定植株性别。

4原理

美洲黑杨属于雌雄异株植物，为XY性别决定型，其性别二态性主要体现在花器官差异。雌性花器官由多个雌蕊构成的柔荑花序，不含雄蕊；雄性花器官由多个雄蕊构成的柔荑花序，不含雌蕊。在达到性成熟后，雌性花器官授粉产生大量包裹种子的飞絮，造成了严重的环境污染；雄株则不产生飞絮。所以，通过选育不飞絮雄性良种进行现有品种的更新替代，可以从根本上杜绝杨絮的产生，推动杨树产业的发展。但是，美洲黑杨的童期一般是5-7年，无法在性成熟前通过外观直接鉴定性别。所以在品种的选育过程中，由于不能在苗期进行性别鉴定，往往需要等到植株开花后才能选育不产生杨絮的雄株，淘

汰产生杨絮的雌株，该做法既浪费了一半的财力人力，也提高了一倍的工作量。另外，对市场上1~3

2

T/JSFXXXX—2XXX

年生的商品树苗不能鉴定其性别，容易存在雌株混入雄性品种中，造成飞絮对环境的污染。因此，建立美洲黑杨性别早期鉴定的标准体系，不仅可以提高不飞絮雄性良种的选育效率，还有助于对美洲黑杨商

品苗性别的检测，减少雌性商品苗的流通。

项目申请团队以美洲黑杨为材料，通过群体遗传学和全基因组关联分析，发现美洲黑杨的性别决定区间（SDR）位于19号染色体（Chr.19）的末端。同时对性别决定区间的X和Y单倍型拆分，结合区间预测基因的时空表达模式和遗传转化功能验证，确定美洲黑杨性别由SDR-Y单倍型中一段42Kb的特异序列上的两个基因（FERR和MSL）决定，在X单倍型上不存在等位基因序列。因此，我们在美洲黑杨性别决定基因所在的Y单倍型42Kb区间内开发通用SSR引物（NJFU582、NJFU600和NJFU602），在自然群体中进行实验检测，结果显示所开发的3对通用SSR引物均在雄株中可以获得单一扩增产物，均在雌株中不能获得任何扩增产物。综上，当依据本标准进行美洲黑杨性别鉴定时，可采集待测植株根茎叶等任一幼嫩组织提取DNA为模板，以本标准公布的微卫星引物进行PCR扩增，通过聚丙烯胺凝

胶电泳检测扩增产物，若待测样品检测到单一扩增产物，即为雄株；若未检测到扩增产物，则为雌株。

5主要仪器和设备

5.1样品快速研磨仪（样品量48×2ml，速度10-70HZ/秒）

5.2双板夹芯式垂直电泳槽（凝胶板120mm×180mm，40齿，1.00mm厚）。

5.3离心机12000r/min。

5.4微量可调移液器(2μL、10μL、100μL、1000μL)。

5.5PCR扩增仪。

5.6EPS-300数显式稳压稳流电泳仪(电压10V~300V，电流10mA~400mA)。

5.7全自动数码凝胶图像分析系统(透射紫外波长：302nm，透射紫外面积：20cm×20cm)。

5.8微量核酸蛋白检测仪(波长范围：190nm~840nm，波长精度1nm，检测范围2ng/μL~15000ng/μL)。

6试剂与溶液

6.1除非另有说明，在分析中所使用的所有试剂均为分析纯。实验中所使用的水均为无菌超纯水。

6.21mol/LTris-HCl(pH8.0)：称取121.1g三羟基甲烷（Tris）溶解于800mL超纯水，约加入42ml的浓盐酸将pH值调到8.0，定容到1L，200mL分装后高压灭菌，室温保存。

6.30.5mol/LNa-EDTA(pH8.0)：称取186.1g乙二胺四乙酸二钠（Na.EDTA）溶解到700mL超纯水，约加入20g氢氧化钠（NaOH）调pH值至8.0，定容到1L，