拟南芥细胞周期调控因子KRP2的原核表达及蛋白纯化 .pdfVIP

拟南芥细胞周期调控因子KRP2的原核表达及蛋白纯

化

植物表皮毛是植物地上组织表皮细胞形成的一种特化结构，

与表皮铺板细胞持续进行有丝分裂不同，表皮毛细胞在命运决定

之后将退出有丝分裂周期转而进入核内复制。在模式植物拟南芥

中，成熟的叶片表皮毛细胞需要经历4次核内复制，从而使其核

内DNA含量达到32C，进而形成特定的形态。细胞周期调控因

子在细胞由有丝分裂向核内复制转换的过程中发挥着关键的调

节作用，其中细胞周期素依赖性激酶（CDK）是植物细胞周期的

中心调控因子，细胞周期的一些进程是通过调节CDKs活性进行

的。与细胞周期素相对的是CDK抑制因子，它通过与CDKs直接

结合负调控CDKs活性。植物中第1种CDK抑制因子是由7种

基因共同编码的kip相关蛋白家族（KRP）：ICK1/KRP1、ICK2/KRP2、

KRP3、KRP4、KRP5、KRP6、KRP7。ICK1/KRP1、ICK2/KRP2、KRP6

过表达强烈抑制生长并且影响器官形态建成。KRPs是一类带有

C末端区域（CTD）的小蛋白，它是结合CDK或细胞周期蛋白并

执行KRPs抑制功能所必需的一类因子。而CDK活性在G1/M期

和G2/M期转换时会升高并且与蛋白磷酸化、起始DNA复制、

有丝分裂相关;转录水平调控、蛋白互作、转录后修饰或蛋白降解

都能改变CDK活性，最终调控细胞周期进程。酵母双杂体系中

除了KRP5，其他KRPs都与CDKA;1（A类CDK激酶）互作而不

与CDKB1;1互作，并且所有的KRPs可以与D型细胞周期素互

作，表明KRPs抑制CYCD-CDKA复合物活性。

CDKA;1和其特异性抑制因子KRP2调控拟南芥叶片发育过

程中有丝分裂向核内复制的转换。在有丝分裂活性组织中，调节

KRP2过表达可降低CDKA;1活性，而在核内复制的组织中它的

活性不会降低，反而促进核内复制。CDKA;1的弱表达导致了CDK

有丝分裂活性的特异性抑制，从而诱导核内周期。CDKB1;1通过

使KRP2磷酸化调控蛋白酶体降解;CDKB1;1的mRNA和蛋白水

平在有丝分裂组织中要高于核内复制组织，表明CDKB1;1促进

KRP2降解并且通过维持CDKA;1活性来抑制有丝分裂进入核内

周期。KRP2蛋白可以通過CDK磷酸化和蛋白酶体降解机制调节

转录后翻译，不同CDK蛋白之间的互作可以控制不同时期特异

的CDK活性。

为进一步研究KRP2在高等植物细胞周期中的生物学功能，

本研究对拟南芥KRP2基因CDS序列进行克隆，并在其3′端添加

编码FLAG标签的核苷酸序列，构建了pET-28a-KRP2-FLAG融

合表达载体;通过在大肠杆菌BL21（DE3）中体外表达，利用镍柱

亲和层析纯化，成功获得了His-KRP2-FLAG重组蛋白。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1植物材料、菌株和载体拟南芥Columbia（Col-0）生

态型野生型种子、大肠杆菌TOP10和BL21（DE3）、原核表达载

体pET-28a，均由西北农林科技大学生命科学学院分子遗传实验

室保存。

1.1.2试剂试验中用到的限制性内切酶、高保真DNA聚合

酶PrimeStar、T4连接酶、牛小肠碱性磷酸酶（CIAP）、反转录

酶等购自Takara公司;His标签蛋白纯化柱填料NiSepharose6

FastFlow、硝酸纤维素膜（0.45μm），购自通用电气医疗集团生

命科学部;6xHis抗体购自Abcam公司，FLAG抗体购自Sigma公

司。

1.2方法

1.2.1拟南芥KRP2基因片段克隆提取野生型拟南芥总RNA，

反转录获得cDNA;以此为模板用带BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点的

引物进行PCR扩增;引物序列F：5′-********************G-3′;R：

5′-***********************************ACCC-3′（下划线分别表示

BamHⅠ