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泸州医学院学报２００８年第３１卷第２期
１２６ＪｏｕｒｎａｌｏｆＬｕｚｈｏｕＭｅｄｉｃａｌＣｏｒｔｅｇｅＶｏ１．３１Ｎｏ．２２００８
Ｋｉ－Ｐ２１ｒａｓ蛋白原核表达质粒的构建、
表达及纯化的研究
周云刚，杨举伦，王力，赵稳兴
泸州医学院心血管医学研究所，四川泸州（６４６０００；成都军区昆明总医院病理科）
摘要目的：构建Ｋｉ—ｒａ￥一ＰＥＴ一２８ｏｒ＋）（原核表达质粒，并表达、纯化得到１（ｉ—Ｐ２１ｒａｓ蛋白。方法：人工合成Ｋｉ—ｒａｓ基因ｃＤＮＡ
的蛋白编码ＣＤｓ区序列，并在其正义链５加上ＢａｍＨＩ酶切位点，３加上－ＩＩｉｎｄＩＩＩ酶切位点，经过Ｂａｍ－ｌＩＩ和ＨｉｎｄⅢ双酶切后纯化回
收得到具有粘性末端的Ｋｉ—ｒａｓｃＤＮＡ，将ＰＥＴ一２８ｅｔ（＋）同样经过ＢａｍＨＩ和ＨｉｎｄⅢ双酶切后纯化回收得到与Ｋｉ—ｒａ￥ｃＤＮＡ有相同
粘性末端的线形片段，通过Ｔ４ＤＮＡ连接酶将具有粘性末端的Ｋｉ—ｒａｓｃＤＮＡ与酶切后的ＰＥＴ一２８仅＋）（定向连接，构建重组质粒１（ｉ—
ｒａ￥一ＰＥＴ一２８ａ（＋），经酶切和测序鉴定。将鉴定正确的Ｋｉ—ｒａｓ—ＰＥＴ一２８仅＋）（转入感受态细菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中诱导表达，利用组氨酸
“标签”（Ｈｉｓ－Ｔａｇ）对Ｐ２１ｒａｓ进行亲和层析纯化。结果：测序分析证实，克隆人ＰＥＴ－２８ａ（＋）的Ｋｉ—ｒａｓ序列与Ｇｅｎｂａｎｋ登录号为
“Ｍ５４９６８”的Ｋｉ－ｒａｓｃＤＮＡ序列一致，将重组质粒Ｋｉ—ｒａｓ—ＰＥＴ一２８仅＋）（转化ＢＬ２１（ＤＥ３），ＩＰＴＧ诱导目的蛋白表达。ＳＤＳ—ＰＡＧＥ和蛋
白纯化结果表明，Ｋｉ－ｒａｓ—ＰＥＴ一２８仅＋）（在大肠杆菌中获得可溶性高表达，经Ｎｉ２＋ｍＮＴＡ一树脂柱亲和层析纯化得到了ＰＡＧＥ纯的
ｋｉ－Ｐ２１ｍｓ蛋白，Ｗｅｓｔｅｒｎ—Ｂｌｏｔ分析证实其免疫活性。结论：成功构建了原核表达载体Ｋｉ—ｒａ￥一ＰＥＴ一２８ａ（＋），并经表达、纯化得到具
有生物活性的Ｐ２１ｒａｓ蛋白，为研究Ｐ２１ｒａｓ在肿瘤发病中的作用和机制以及抗Ｐ２１ｒａｓ细胞内抗体的研究奠定了基础。
关键词Ｐ２１ｒａｓ；原核表达；亲合纯化；免疫活性
中图分类号Ｒ３６２文献标识码Ａ文章编号１０Ｏｏ＿２６６９（２００８）２－ｏ１２６—０４
ＣｏＮＳＴＲＵＣＴＩｏＮｏＦＰＲｏＫＡＲＹｏＴＩＣＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ
ＰＬＡＳＭＩＤⅪ一ＲＡＳ—ＰＥＴ一２８仪（＋）ＡＮＤＥＸＰＲＥＳＳＩｏＮ
ＡＮＤＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＮｏＦＰ２１ＲＡＳ
ＺｈｏｕＹｕｎｇａｎｇ，ｅｔａｌ
ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＣａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒＭｅｄｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ，ＬｕｚｈｏｕＭｅｄｉｃａｌｃ０
ＡｂｓｔｒａｃｔＯｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔｔｈｅｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｌａｓｍｉｄＫｉ—ｒａｓ—ＰＥＴ一２８（＋）ａｎｄｔｏｏｂｔａｉｎｔｈｅ
ｐｕｒｉｆｉｅｄｐｒｏｔｅｉｎｏｆＰ２１ｒａｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：ＡｆｔｅｒｔｈｅＣＤｓｏｆＫｉ—ｒａｓｃＤＮＡｗｉｔｈｅｎｚｙｍｅｓｉｔｅＢａｍＨＩａｎｄＨｉｎｄＩＩ１ｗｅｒｅ
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