DB35T 1938-2020 饲料中沙门菌和沙雷菌二重实时荧光PCR检测方法.docxVIP

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DB35

福建省地方标准DB35/T1938—2020

饲料中沙门菌和沙雷菌二重实时荧光PCR检测方法

Duplexreal-timePCRassayforSalmonellaandSerratiainfeeds

2020-09-29发布2020-12-29实施

福建省市场监督管理局发布

I

DB35/T1938—2020

目次

前言 II

1范围 1

2规范性引用文件 1

3缩略语 1

4检测原理 1

5主要仪器 2

6培养基和试剂 2

7样品的采集和制备 2

8操作步骤 2

9检测过程中防止交叉污染的措施 4

附录A（规范性附录）培养液的配制 5

II

DB35/T1938—2020

前言

本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。

本标准由中华人民共和国福州海关提出并归口。

本标准起草单位：福州海关技术中心、海口海关技术中心、福建农林大学动物科学学院、厦门瑞德利校准检测技术有限公司。

本标准主要起草人：王武军、张体银、吴山楠、阮靖华、郑腾、俞道进、郑晶、白泉阳、王莹莹、张志灯、于师宇、林杰。

1

DB35/T1938—2020

饲料中沙门菌和沙雷菌二重实时荧光PCR检测方法

1范围

本标准规定了饲料中沙门菌和沙雷菌二重实时荧光PCR检测方法有关的检测原理、主要仪器、培养基和试剂、样品的采集和制备、操作步骤、检验过程中防止交叉感染的措施。

本标准适用于饲料中沙门菌和居泉沙雷菌的快速检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB/T13091饲料中沙门氏菌的测定

GB19489实验室生物安全通用要求

3缩略语

下列缩略语适用于本文件。

Real-timePCR：荧光PCR（Real-timePolymeraseChainReaction）DNA：脱氧核糖核酸（DeoxyribonucleicAcid）

Ct值：每个反应管内的荧光信号量达到设定的荧光阈值时所经历的循环数（CycleThresholdValue）

4检测原理

4.1用非选择性液体培养基预增菌

将饲料样品接种到缓冲蛋白胨水，在36℃±1℃条件下培养16h～20h。

4.2在选择性培养基上增菌

将4.1中的培养物接种到亚硒酸盐胱氨酸培养基和氯化镁-孔雀绿培养基中，分别于36℃±1℃、42℃±1℃条件下培养24h。

4.3提取DNA进行实时荧光PCR检测和判断

提取4.2中培养物的DNA。采用TaqMan方法，分别设计针对沙门菌属和居泉沙雷菌的特异性引物和特异性的荧光探针进行配对。当样品中含有沙门菌或居泉沙雷菌时，前增菌后提取的细菌DNA通过PCR成指数扩增，在反应过程中沙门菌特异的荧光探针跟靶核酸杂交，同时被Taq酶水解，把探针上的荧光基团和淬灭基团分开，游离的荧光基团信号被检测仪所接收。随着PCR反应的循环进行，PCR产物与荧光信号的增长呈对应关系。从而通过荧光增量来实时判断沙门菌和居泉沙雷菌的存在与否。

2

DB35/T1938—2020

5主要仪器

5.1恒温培养箱：36℃±1℃,42℃±1℃。5.2振荡器。

5.3电子天平：感量0.1g。

5.4无菌锥形瓶：容量500mL、250mL。

5.5单道可调移液器：容量0.2μL～1mL。5.6生物安全柜。

5.7荧光PCR仪。5.8冷冻离心机。5.9高压灭菌器。

6培养基和试剂

6.1水：应符合GB/T6682中三级水的要求。

6.2缓冲蛋白胨水（BPW）：配制方法按照附录A中的A.1。

6.3氯化镁-孔雀绿（RV）增菌液：配制方法按照附录A中的A.2。6.4亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液：配制方法按照附录A中的A.3。6.5商品化的实时荧光PCR预混液。

6.6商品化的细菌基因组DNA提取试剂盒，具体提取操作参照说明书进行。6.7沙门菌荧光PCR检测用引物（对）和探针序列为：

invA-F：