GST-pull-down实验原理与步骤 .pdfVIP

GSTpulldown实验原理与步骤

GSTpulldown（GST融合蛋白沉降技术）是体外检测蛋白相互作用的常用方法，可验

证已知蛋白之间的互作，也可用于筛选与已知蛋白互作的未知蛋白。此方法操作方便，简

单易行。

GSTpulldown实验原理

GSTpulldown的主要原理是利用DNA重组技术将已知蛋白与GST融合，而融合蛋白

通过GST与固化在载体上的GTH（谷胱甘肽）亲和结合。简单来说，我们假定a蛋白和b

蛋白可能存在互作，将纯化的融合GST的a蛋白和纯化的b蛋白以及能特异性结合GST

的Sephrose4Bbeads混合在一起孵育一定时间，然后洗去未结合的蛋白，煮沸beads进行

SDS电泳。通过Westernblot检测结果，我们可以看到GST-a蛋白和b蛋白所对应

的条带，即表明了a蛋白和b蛋白因发生相互作用而被GST-apulldown（GST对照只显示

一个条带）。

GSTpulldown实验步骤

一、GST-a融合蛋白的制备

1．GST-a融合蛋白的表达

(1)将目的蛋白与GST的重组质粒转化到BL21菌株中；

(2)挑取单克隆到含有5mlLB培养基（加入5ul氨苄）的10ml试管里，37℃恒温振荡培养

箱中培养过夜；

(3)将培养菌液转移到含有500mlLB（含500ul氨苄）的1L锥形瓶中，37℃，200rpm培养

数小时；

(4)测定OD600值，当OD600达到0.6左右时，加入适当浓度的IPTG，在20℃，200rpm

条件下培养10-16h（通常需要进行预实验以确定最佳IPTG浓度、诱导温度和时间）；

(5)诱导适当时间后，将菌液分次倒入50ml离心管中，4℃4000rpm离心10分钟，然后弃

去上清，收集管底菌体，如暂时不用，可将菌体保存于-80℃冰箱中；

(6)先加入少量PBS于离心管中，离心5-10min后弃去上清，再按每10ml菌液沉淀1mlPBS

的量加入相应的PBS，涡旋振荡，使菌体沉淀充分溶解于PBS溶液中；

(7)把混合菌体置于冰水浴中，用超声仪进行破碎。每次超声破碎20s，间隔30s（破碎时间、

破碎次数和间隔时间视具体情况而定），经过适当时间超声后，溶液会显得澄清；

(8)将超声后的溶液4℃4000rpm离心10分钟，上清液转移至新的离心管中，-80℃保存备

用。

2．GST-a融合蛋白的纯化

(1)在新鲜制备的裂解液上清中加入适量体积50%GlutathioneSepharose4B，4℃摇床上缓

慢摇动30~60min;

(2)4℃，4000rpm离心5min，弃去上清，该Sepharose上结合了GST-a融合蛋白；

(3)加入200ul预冷的PBS溶液，轻晃悬浮珠子，将Sepharose洗涤一次，4℃，4000rpm离

心5min，弃去上清，重复此步骤3次；

(4)最后一次用移液枪吸走珠子表面的液体，但注意不要吸走珠子，即可获得结合GST-a

的Sepharose。

二、b蛋白的制备

b蛋白可融合His标签进行原核表达，也可融合Flag/HA/Myc等标签进行真核表达。

通常融合His标签进行原核表达，详细步骤参见His标签蛋白纯化原理与步骤。

体外蛋白的结合

(1)将结合有GST-a融合蛋白的Sepharose4B悬浮在适量体积的缓冲液中，加入20ul含有b

蛋白的溶液，同时采用结合有GST蛋白的Sepharose作为阴性对照，在摇床上晃动4-8h（4℃）；

(2)4℃，4000rpm离心5min，弃去上清液；

(3)沿壁加入200ul预冷的缓冲液对Sepharose进行洗涤，

(4)4℃，4000rpm离心5min，弃上清，该步骤重复3次；

(5)吸干Sepharose上面的液体后，加入20ul1×蛋白电泳上样缓冲液，沸水浴5min，放入-20℃

冰箱备用；

(6)通过SDS和Westernblot进行检测。