生理指标的测定1 .pdfVIP

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一叶绿素的测定-丙酮乙醇提取比色法

参照张宪政（1986）的方法:

1、先配制乙醇：丙酮=1：1的混合溶液（80%:80%）装入棕色瓶中保存。

2、取叶片0.5-1g剪碎，放入50ml的培养瓶中，再加入20ml的配制好的上述混合液，盖上瓶盖，置于

10℃冷库避光存放36h(直到叶片泛白)，其间摇晃2-3次，使叶绿素充分溶解在混合液中。

3、避光保存36h后，过滤混合溶液，以提取液作为对照，在紫外分光光度计下分别测定652nm、663nm

和645nm处的吸光值。

4、计算公式

叶绿素a的含量=（12.7*OD-2.69*OD）/50+

663645

（22.9*OD-4.68*OD）/50

663645

叶绿素b的含量=（22.9*OD-4.68*OD）/50

663645

总叶绿素的含量=（20.2*OD+8.02*OD）*V/1000*W

645663

或总叶绿素的含量=(A/34.5)*V/1000*W(叶绿素a和叶绿素b在652nm下有相同的吸光系数，为34.5)

652

其中V为提取液体积，W为叶片重量，叶绿素含量单位为mg/g(FW).

二、维生素C含量的测定

李合生，2000年，比色法：常规测定抗坏血酸的方法是采用2，6—二氯酚靛酚滴定法，但因某些叶片

中花青素量较高，当用酸提取时呈红色，因而无法滴定。本实验采用二甲苯萃取比色法，测不受花青素的

干扰。

1、原理：向一定量提取液中加入过量的2，6—二氯酚靛酚染料溶液与维生素C作用后，多余染料用二甲

苯萃取比色。待测液中抗坏血酸的含量与二甲苯萃取的颜色呈线性负相关，即待测液中抗坏血酸含量越多，

未被还愿的染料就越少，二甲苯萃取的颜色也就越浅。由于水溶性的花青素不溶于二甲苯，因而不影响测

定结果。

2、试剂（按照定容100ml计算）

(1)1%草酸，称取1.4g；

(2)2%草酸,称取2.8g；

(3)30%硫酸锌,称取53.4g；

(4)15%亚铁氰化钾,称取17.2g；

(5)染料溶液：称取100mg2，6—二氯酚靛酚和82mg碳酸氢钠溶于约60ml热水中，过滤定容至100ml容

量瓶中，倒入棕色试剂瓶存放于冰箱内。使用时稀释4倍，此溶液每毫升约相当于0.1mg的维生素C。

(6)抗坏血酸标准溶液：精确称取100mg分析纯抗坏血酸，溶于1%草酸，定容至100ml，再从中吸取5ml，

用1%草酸再稀释至100ml,稀释后每毫升含抗坏血酸0.05mg（标准溶液在使用前临时配置）

(7)二甲苯,分析纯（本法使用过的二甲苯可用20%NaOH中和后，蒸馏回收）。

3、实验步骤

(1)标准曲线

去具塞大试管6个，分别吸取抗坏血酸标准溶液0ml、1ml、2ml、2.5ml、3ml、4ml，用1%草酸补充至

4ml，各管中抗坏血酸含量相应为0mg、0.05mg、0.10mg、0.125mg、0.15mg、0.20mg。各管中加入染料溶

液2ml，随即加入二甲苯5ml,迅速摇动约0.5min,静置后二甲苯与水层分离，将上层二甲苯萃取液轻轻

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倒入比色杯，在500nm波长下测定吸光度。以二甲苯作空白调零，求得标准系列抗坏血酸毫克数与相应的

吸光度值的回归方程。

(2)样品提取

取新鲜蔬菜洗净，擦干，在玻板上用不锈钢刀切碎混匀。称取2g样品放置研钵中，加入3ml2%草酸研

钵至匀浆，然后将匀