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荧光定量原理及其应用;实时荧光定量PCR的基本原理

;长度30-45bp,Tm比引物至少高5℃。

实时荧光定量PCR的基本原理

优点：通用性好，价格低，在科研中使用较普遍。

在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

实时荧光定量PCR的基本原理

5’端不要有G，G会有淬灭作用，影响定量。

缺点：PCR反应中的非特异性扩增或引物二聚体也会产生荧光，通常本底较高，引起假阳性。

其中最主要的应用集中在以下几个方面：

荧光背景信号阶段：为扩增最初的10～15个循环，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，我们无法判断产物量的变化。

TaqMan探针是一种寡核苷酸探针，荧光基团连接在探针的5’末端，而淬灭剂则在3’末端。

DNA或RNA的绝对定量分析：包括病原微生物或病毒含量的检测,转基因动植物转基因拷贝数的检测，RNAi基因失活率的检测等。

当完整的探针与目标序列配对时，荧光基团发射的荧光因与3’端的淬灭剂接近而被淬灭。

基因表达差异分析:例如比较经过不同处理样本之间特定基因的表达差异(如药物处理、物理处理、化学处理等)，特定基因在不同时相的表达差异以及cDNA芯片或差显结果的确证.;;荧光背景信号阶段：为扩增最初的10～15个循环，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，我们无法判断产物量的变化。

平台期：扩增产物已不再呈指数级的增加。PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA拷贝数。;;荧光阈值：是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。

CT值：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为CT值。;目前实时荧光PCR技术已经被广泛应用于基础科学研究、临床诊断、疾病研究及药物研发等领域。

SYBRGreenI工作原理

实时荧光定量PCR的应用

TaqMan探针是一种寡核苷酸探针，???光基团连接在探针的5’末端，而淬灭剂则在3’末端。

SYBRGreenI工作原理

DNA或RNA的绝对定量分析：包括病原微生物或病毒含量的检测,转基因动植物转基因拷贝数的检测，RNAi基因失活率的检测等。

当存在模板时，环序列将与模板配对，此时分子信标成链状而非茎环状，荧光基团与淬灭剂分开，使得荧光基团发出荧光。

其他定量方法

优点：通用性好，价格低，在科研中使用较普遍。

引物的Tm值应相似，差异不超过1～2℃.

荧光扩增曲线分为三个阶段：荧光背景信号阶段、荧光信号指数扩增阶段和平台期。

SYBRGreenI工作原理

在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

水解探针模式（Taqman）

利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中纵坐标代表起始拷贝数的对数，横坐标代表Ct值。

长度30-45bp,Tm比引物至少高5℃。

Taqman探针设计原则

G+C含量为40～60%。;;定量方法;;其他定量方法;荧光定量PCR检测模式;检测模式;

在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

SYBRGreenI工作原理;;水解探针模式（Taqman）;一分子的产物生成就伴随着一分子荧光信号的产生，随着循环数增加，荧光信号不断积累。;当存在模板时，环序列将与模板配对，此时分子信标成链状而非茎环状，荧光基团与淬灭剂分开，使得荧光基团发出荧光。

实时荧光定量PCR的应用

Taqman探针设计原则

长度30-45bp,Tm比引物至少高5℃。

引物设计原则

平台期：扩增产物已不再呈指数级的增加。

PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA拷贝数。

每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图