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灌木辣椒种质鉴定技术规程SSR分子标记法

1范围

本标准规定了利用简单重复序列（Simplesequencerepeats，SSR）分子标记法快速鉴定灌木辣椒（CapsicumfrutescensL.）种质技术有关的术语和定义、仪器设备与主要试剂耗材、溶液配制、核心引

物、参照种质、操作步骤、指纹比对和结果判定。

本标准适用于灌木辣椒（CapsicumfrutescensL.）种质的SSR分子指纹比对鉴定。

2规范性引用文件

下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本规程，凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用

于本标准。

GB/T3543.2农作物种子检验规程。

3术语和定义

下列术语和定义适用于本标准。

3.1待测种质

待鉴定的疑似灌木辣椒种质，由送检人提供。

3.2参照种质

用于与待测种质进行指纹比对的若干标准灌木辣椒种质和一年生辣椒种质。

3.3核心引物

多态性好、PCR扩增稳定的一套SSR引物。

3.4指纹图谱

采用SSR核心引物（或相当于核心引物）扩增出的待测种质和参照种质的DNA片段，通过变性聚

丙烯酰胺电泳，得到不同大小的DNA片段图谱。

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3.5指纹比对

将待测种质与参照种质的SSR指纹图谱进行比对，分析待测种质与参照种质的SSR指纹是否有差

异，并确定其大小。

4原理

SSR分子标记，广泛分布于辣椒基因组中。不同种质间每个SSR位点重复单位的数量可能不同，因而形成SSR标记多态性。由于每个SSR位点两侧的序列一般是相对保守的单拷贝序列，因此可根据其两侧的序列设计一对特异引物，利用PCR技术对两条引物间的DNA序列进行扩增。通过电泳分离得到大小不同的扩增产物片段，经硝酸银染色加以区分。因此，根据SSR位点的多态性，利用PCR扩增

和电泳技术可以鉴定灌木辣椒品种。

5仪器设备与主要试剂耗材

仪器设备及试剂、耗材参见附录A。

6溶液配制

溶液配制方法参见附录B。

7核心引物

核心引物相关信息见附录C。

8参照种质

参照种质参见附录D。

在进行等位变异检测时，应同时包括相应参照品种。

9操作步骤

9.1样品准备

种子样品的扦样和保存，按照GB/T3543.2的规定执行。

取待测种质和参照种质的新鲜、幼嫩、健康叶片1片，每个种质取10个个体，混合制样并做好标

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记，用纱布包好并置于液氮罐中。

9.2DNA提取

9.2.1待测种质和参照种质采用改良CTAB法提取DNA，步骤如下：

a）将混合样品放入研钵中用液氮磨成粉末，然后迅速用2ml离心管将粉末勺进管的2/5处，迅速加入预热至65℃的CTAB提取液1ml（加入前先加入1%的β-巯基乙醇），充分混匀后将2ml离心管放

入65℃水浴锅中，水浴60min，每隔5min摇荡一次，使之充分反应。

b）取出离心管静置至数分钟后放入4℃高速低温离心机中，13000rpm离心15min。取上清液至另一离心管，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）后，充分混匀，静置10min。13000rpm离心10

min。

c）取上清液800μl置于新的1.5ml离心管中。加入2/3体积冷的异丙醇，轻晃，置于-20℃冰箱30

min或者过夜。

d）取出步骤c的离心管在4℃下条件下，13000rpm离心10min，弃上清。用75%乙醇洗涤DNA

两次，放在桌面自然晾干。

e）向1.5ml离心管中加入200μlddH2O将DNA溶解，再加5μl10mg/mlRNaseA37℃水浴60min。

加入等体积200μl预冷的氯仿：异戊醇（24:1）混匀，静置10min，12000rpm离心10min。

f）取上清加入1/10(总)体积的NaAc（3mol/L），2倍体积冷的无水乙醇。-20℃放置30min或更

长时间，在4℃下13000rpm，离心15min。用冷的75%乙醇洗涤沉淀两次，放至桌面自然晾干。

g）加200μl灭菌1×TE溶解DNA，并用核酸测定仪检测DNA浓度，将DNA稀释到20ng/μl最后

将离心管放入-20℃冰箱保存备用。

9.2.2若采用试剂盒法提取DNA