DB21T 2327-2014 猪圆环病毒2型实时荧光PCR检测方法.docxVIP

ICS11.220B41

DB21

辽宁省地方标准

DB21/T2327—2014

猪圆环病毒2型实时荧光PCR检测方法

MethodofrealtimefluozescentPCRforthedetectionofporcinecircovirustype2

2014-07-05发布2014-09-05实施

辽宁省质量技术监督局发布

I

DB21/T2327—2014

前言

本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由辽宁省动物疫病预防控制中心提出。本标准由辽宁省畜牧兽医局归口。

本标准起草单位：辽宁省动物疫病预防控制中心、辽宁省动物医学研究院。

本标准主要起草人：于学武、顾贵波、赵晓彤、崔基贤、陈瑶、魏澍、马建山、王竹、申贯男、赵凤菊、李璐、李晓楠、于丹、王海丰

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DB21/T2327—2014

猪圆环病毒2型实时荧光PCR检测方法

1范围

本标准规定了猪圆环病毒2型（porcinecircovirustype2，PCV2）实时荧光PCR检测方法的实验技术要求。

本标准适用于PCV2的诊断、监测及流行病学调查，适用于猪脏器、血液、排泄物和细胞培养物中PCV2核酸的检测。

本标准中的试验操作应在生物安全Ⅱ级（BSL-2）以上的实验室进行。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

兽医实验室生物安全技术管理规范

3缩略语

下列缩略语适用于本标准。

PCV2：猪圆环病毒2型（porcinecircovirustype2）

HSTaq酶：热启动TaqDNA聚合酶（HSTaqDNApolymerase）Ct值：达到阈值的循环数（cyclethreshold）

DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）

实时荧光PCR：荧光聚合酶链式反应（realtimefluozescentquantitativepolymerasechainreaction）PBS：磷酸缓冲液（phosphatebuffersolution）

4原理

根据PCV2基因特定序列的保守片段，合成一对特异性引物和一条特异性探针。荧光探针的5’端标记FAM荧光素，3’端标记TAMRA荧光素，3’端的淬灭基团在近距离内能吸收5’端报告荧光基团发出的荧光信号。但在扩增时，由于Taq酶的5’→3’的外切活性，在延伸到荧光探针时，将探针切断，两基团分离，淬灭作用消失，荧光信号产生。因此，可通过检测荧光信号对核酸进行检测。

5仪器和器材

5.1仪器

主要仪器有分析天平、高速离心机、荧光PCR扩增仪、-70℃冰箱、-20℃冰箱、水浴锅、可调移液器（最大量程为2μL，20μL，200μL，1000μL）。

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5.2器材

主要器材有组织匀浆器或研钵、眼科剪、眼科镊、10mL一次性注射器、1.5mL灭菌离心管、PCR八联排管或96孔板、吸头（10μL，200μL，1000μL）、灭菌双蒸水、称量纸。

6试剂和材料

6.1DNAzol?Reagent：DNA抽提试剂，外观为淡绿色，于4～8℃保存。

6.2PremixExTaqTM（ProbeqPCR）：TaqMan探针法进行RealtimePCR反应的专用试剂，为PCRBuffer、dNTP、RNaseH和HSTaq酶的预混液，于-20℃长期保存，融化后于4～8℃保存。

6.3PBS：磷酸盐缓冲液（0.02mol/LpH7.2）。

6.4无水乙醇：-20℃预冷。

6.575%乙醇：用无水乙醇和灭菌双蒸水配制，-20℃预冷。

6.6阴性对照：灭菌双蒸水。

6.7阳性对照：PCV2细胞培养物。

注：本标准所用试剂，除特殊标注外，均为分析纯。

7操作步骤

7.1样品的采集、前处理、存放和运送

7.1.1采样注意事项

采样及样品前处理过程中应戴一次性手套，样本间不得交叉污染。

7.1.2采样工具

药匙、15mL离心管和1.5mL离心管经121(±2）℃高压灭菌15min；剪刀、镊子经160℃干热灭菌2h。

7.1.3内脏样