DB21T 2396-2015 水稻品种抗稻瘟病基因检测 PCR法　.docxVIP

ICS65.020.01B04

DB21

辽宁省地方标准

DB21/T2396—2015

水稻品种抗稻瘟病基因检测PCR法

2015-05-18发布2015-07-18实施

辽宁省质量技术监督局发布

I

DB21/T2396—2015

前言

本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由辽宁省农业科学院提出。

本标准由辽宁省农村经济委员会归口。

本标准由辽宁省农业科学院创新中心负责起草。

本标准主要起草人：陆晓春、郑文静、丛玲、赵家铭、王妍、张丽霞、白春明、王春语、朱振兴、马丽、

李丹、王平、李金红等。

本标准由辽宁省农业科学院创新中心负责解释。

1

DB21/T2396—2015

水稻品种抗稻瘟病基因检测PCR法

1范围

本标准规定了检测水稻品种抗稻瘟病基因的PCR检测法，包括原理、仪器设备、试剂和材料、防污染措施、实验步骤及结果分析。

本标准适用于水稻品种中抗稻瘟病基因pita、pid2、pid3、pik、pikp、pikm、piks、pi21、pi36、pi37和pi5的检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求

农业部1485号公告--4—2010转基因植物及其产品成分检测DNA提取和纯化

3术语及缩略语

下列术语及缩略语适用于本标准

3.1正向引物：处于DNA双链上游的引物，简称F引物。

3.2反向引物：处于DNA双链下游的引物，简称R引物。

3.3内参引物：在聚合作用起始时，可以刺激合成另一种大分子，并与反应物以共价键形式连接的序列。

3.4DNA:Deoxyribonucleicacid,脱氧核糖核酸。

3.5PrimeSTARHSDNAPolymerase:高保真DNA聚合酶。

3.6PrimeSTARBuffer（5×):5×PCR反应液。

3.7dNTPMixture（10mM）:单核苷酸混合液（10mM）。

3.8PCR:Polymerasechainreaction。

3.9TAE：Tris-Cl、冰醋酸、EDTA缓冲液。

2

DB21/T2396—2015

3.10Goldenview：核酸染料，替代溴化乙锭。

3.11DNAMarker：标准分子量的核酸标记。

3.12bp:Basepair,碱基对。

3.13Tris：tris(hydroxymethyl)aminomethane，三羟甲基氨基甲烷。

4原理

根据水稻抗病基因保守区序列设计特异性引物，提取不同水稻品种的DNA，对试样进行PCR扩增，依据是否扩增获得预期大小的DNA片段及特定的序列来判断样品是否携带该抗病基因。

5仪器设备

5.1台式离心机。

5.2PCR仪。

5.3凝胶成像系统。

5.4琼脂糖电泳槽及电泳仪等电泳装置。

5.5恒温水浴锅。

5.6分析天平：感量0.1g、0.01g和0.1mg。

5.7具盖塑料离心管：2mL，0.2mL。

5.8研钵、研杵。

5.9移液枪和吸头：1000μL,200μL,10μL。

5.10其它相关仪器设备

6试剂和材料

6.1供试水稻叶片或种子。

6.2DNA提取试剂盒。

6.3PrimeSTARHSDNAPolymerase。

6.4PrimeSTARBuffer（5×)。

6.5dNTPMixture（10mM）。

6.6DNAMarker：可以清楚地区分100bp～1000bp的DNA片段。

6.750×TAE缓冲液，使用时稀释50倍。

3

DB21/T2396—2015

6.8加样缓冲液。

6.9引物见附录A。

除非另有说明，仅使用分析纯试剂和重蒸馏水或符合GB/T6682规定的一级水。7防污染措施

检测过程中防止污染的措施按照GB/T19495.2中的规定执行。

8实验步骤

8.1水稻DNA提取

按农业部1485号公告--4—2010的规定执行。

8.2PCR反应

8.2.1将试样DNA、P