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PCR引物设计序列例题

简介

PCR（聚合酶链式反应）是一种常用的分子生物学技术，通过扩增DNA

分子可用于基因克隆、检测等多个领域。而PCR引物则是PCR反应中的

关键组成部分，它们的设计直接影响PCR反应的成功与否。本文为您提

供一些关于PCR引物设计序列的例题，希望对您在实验和研究中的引物

设计有所帮助。

例题一：引物序列设计

为了扩增目标基因的特定片段，我们需要设计一对引物，以下是目标

基因的序列，请根据该序列设计两个引物，使其具有以下要求：

-引物长度在18-25个碱基对之间

-引物的3端碱基G或C

-引物的理论Tm在55-65℃之间

目标基因序列：

AGTCGATCGATTAGCGATCGAGTCGATCGATCGGCTACGATCGA

解答：

根据目标基因的序列，我们可以设计如下两对引物：

引物1：

5-AGTCGATCGATTAGCGATC-3

引物1满足引物长度在18-25个碱基对之间的要求，同时3端碱基

为C，符合要求。接下来我们计算一下该引物的理论Tm。

根据以下两个规则计算引物的理论Tm：

-A与T之间的配对带来的热能释放为-2.2kJ/mol

-C与G之间的配对带来的热能释放为-3.8kJ/mol

根据以上规则，我们可以计算每个碱基的贡献：

-A-T配对:-2.2kJ/mol

-C-G配对:-3.8kJ/mol

-G-C配对:-3.8kJ/mol

-T-A配对:-2.2kJ/mol

引物1的理论Tm计算如下：

(-3.8×4)+(-2.2×10)=-15.2+-22=-37.2kJ/mol

该引物的理论Tm为37.2℃，低于所需的要求。

引物2：

5-CGATCGATCGATCGGCTACG-3

引物2满足引物长度在18-25个碱基对之间的要求，同时3端碱基

为G，符合要求。接下来我们计算一下该引物的理论Tm。

引物2的理论Tm计算如下：

(-3.8×6)+(-2.2×13)=-22.8+-28.6=-51.4kJ/mol

该引物的理论Tm为51.4℃，符合要求。

通过上述设计，我们得到了两对满足要求的PCR引物，可以进行实验

扩增目标基因的特定片段。

例题二：引物特异性验证

为了验证设计的引物对目标基因的特异性，我们需要进行引物特异性

验证实验。以下是目标基因和三个非目标基因的序列，请根据这些序列设

计引物，并通过BLAST分析验证其特异性。

目标基因序列：

CGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCG

非目标基因序列1：

CGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCA

非目标基因序列2：

CGATCGATCGATCGATCGATCGATCCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCG

ATCGATCGATCG

非目标基因序列3：

CGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCA

解答：

根据以上描述的目标基因和非目标基因的序列，我们可以设计如下引

物：

引物1：

5-CGATCGATCGATCGATC-3

引物2：

5-CGATCGATCGATCGATC-3

为了验证引物的特异性，我们可以使用BLAST分析引物与目标基因以

及非目标基因的序列相似性。通过比对结果，我们可以判断引物是否具有

目标基因特异性。

根据实际情况，我将简化引物特异性验证实验的过程与结果。BLAST

分析结果显示引物1与目标基因完全匹配，而与非目标基因序列1和非

目标基因序列3存在1个碱基的差异。引物2与目标基因完全匹配，与

非目标基因序列1存在2个碱基的差