MiSeq System文库变性和稀释指南.pptx

名称

供应商

HT1(HybridizationBuffer),thawedandprechilled

Illumina提供的MiSeqReagentKit

IlluminaPhiXControl,Catalog#FC-110-3001

Illumina(选择)

1.0NNaOH,molecularbiology-grade

一般实验室供应商

Tris-Cl10mM,pH8.5with0.1%Tween20

一般实验室供应商

碱基组成多样性差的文库(lowdiversitylibraries)

Lowdiversitylibraries是大量读数具有相同序列的文库。一些研究表明一种类型转录物、低复杂性扩增子库、接头二聚体或亚硫酸氢盐测序中存在大于25%低序列多样性。PhiX的高浓度加入有助于平衡序列多样性的整体缺失。

对于碱基组成多样性差的文库，将您的PhiX质控文库稀释至与变性文库相同的浓度。

摘要

本指南介绍了对Illumina®MiSeq®system上进行测序的文库进行变性和稀释方法，同时介绍了用作测序控制PhiX文库的制备说明。

耗材和设备

耗材

名称

供应商

hybex微型孵化器(HybexMicrosampleIncubator)

1.5ml的离心管

SciGene,catalog#1057-30-O(115V),orequivalent

SciGene,catalog#1057-30-2(230V),orequivalentSciGene,catalog#1057-34-0,orequivalent

MiSeqSystem文库变性和稀释指南

设备

1试剂准备

1.1准备新鲜稀释的NaOH

取800µLaboratory-gradewater至1.5ml微量离心管中

添加200µL的1.0NNaOH，获得1ml含0.2NNaOH溶液

颠倒1.5ml的离心管数次混匀

注：

始终准备新鲜稀释的NaOH用于变性文库以便簇生成。

为防止小的移液误差影响最终的NaOH浓度，准备至少1ml新鲜稀释的NaOH。

为获得最佳结果，请在变性和稀释文库之前解冻测序试剂。参考MiSeqSystemUserGuide(part

#

1.2准备HT1

将-25°C─-15°C储存的HT1移至室温溶解

待HT1溶解后储存至2°C─8°C冰箱中备用

1.3稀释变性PhiX质控

1.3.1稀释PhiX文库至4nM

取2µl10nMPhiX文库至1.5ml的微量离心管中

添加3µl10mMTris-Cl,pH8.5with0.1%Tween20

1.3.2变性4nMPhiX文库

向上述准备好的4nMPhiX文库中加入5µl已准备好的0.2NNaOH 短暂漩涡混匀后280×g离心1min

室温孵育5min

添加990µl准备好的HT1，获得1ml含20pM变性的PhiX文库

您可以将变性的20pMPhiX文库在-15℃至-25℃下保存3周。3周后，簇数趋于减少

1.3.3稀释PhiX文库至12.5pM(如果您正在使用MiSeq试剂盒v3，则不需要进一步稀释) 取上述已变性的20pMPhiX文库375ul至1.5ml的离心管中

名称

最终PhiX浓度

MiSeqReagentKitv3

将变性PhiX对照稀释至20pM，对于v3试剂能够产生最佳簇密度

MiSeqReagentKitv2

将变性PhiX对照稀释至12.5pM，对于v2试剂能够产生最佳簇密度

确保在用HT1稀释后，最终溶液中NaOH的浓度不超过0.001(1mM)，因为文库中NaOH的浓度抑

制文库与流动槽杂交并降低簇密度。

1.4.2.1变性4nM的文库

取5µl待变性的4nM文库至1.5ml的微量离心管中

添加5µl已准备好的0.2NNaOH

短暂漩涡混匀后280×g离心1min

室温孵育5min

添加990µl准备好的HT1，获得1ml含20p