生物化学酶促反应动力学.ppt

关于生物化学酶促反应动力学pH对酶活性的影响实验原理只有当酶蛋白处于一定的构象及电荷状态，才有利于酶和底物的结合和催化，使酶促反应最强，因此酶反应介质的pH可影响酶分子。在某一pH时，酶的催化活性达到最大值，该pH称为酶的最适pH。碱性磷酸酶的最适pH为8~12。本实验采用磷酸苯二钠法，在不同的pH值的甘氨酸缓冲液条件下，测定其活性，从而确定其最适pH。以磷酸苯二钠为底物，被碱性磷酸酶水解后则产生游离酚和磷酸盐。酚在碱性溶液中与氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化可产生红色的醌类衍生物。根据红色深浅就可测出酶的活性，从而得出酶的最适pH。第2页,共19页，星期六，2024年，5月反应式如下：第3页,共19页，星期六，2024年，5月实验材料甘氨酸缓冲液、0.04mol/L底物液、酶液、0.1mol/LpH10碳酸盐缓冲液、0.5%铁氰化钾液、酚标准液、pH8.8Tris-乙酸缓冲液、碱液、0.3%4-氨基安替比林液、0.04mol/LNa2HPO4第4页,共19页，星期六，2024年，5月实验方法1.取试管6支，编号，表操作管号123456各pH甘氨酸pH8.0pH9.0pH10.0pH11.0pH12.0------缓冲液（ml）1.01.01.01.01.0——蒸馏水（ml）——————————1.00.04mol/L底物液1.01.01.01.01.01.037℃水浴中保温5min酶液（ml）0.10.10.10.10.1——pH8.8Tris-乙酸缓冲液——————————0.1第5页,共19页，星期六，2024年，5月2.加入酶液后，立即计时，混匀后，在37℃水浴中准确保温5min。3.保温后，各管中立即加入碱性液1.0ml终止反应。4.各管中分别加入0.3%4-氨基安替比林液1.0ml及0.5%铁氰化钾2.0ml充分混匀，使呈色完全。室温放置10min，以6号管为空白,不比色,用+来表示颜色的深浅.第6页,共19页，星期六，2024年，5月温度对酶活性的影响实验原理温度对酶活性有显著的影响。温度低时，酶促反应减弱或停止，温度从较低逐渐升高时，反应速度也随之逐渐增加，当温度升高到某一定值时，酶促反应达到最高峰，此温度称为酶的最适温度。但酶是蛋白质，其本身也因温度升高而变性，超过最适温度时，其活性反而降低。一般温度升至80℃以上，酶活性几乎全部丧失。应指出，在进行体外实验时，酶的最适温度会随着保温时间长短而有所变化。本实验以碱性磷酸酶为例，在一定时间，观察酶活性在不同温度下的变化。第7页,共19页，星期六，2024年，5月实验步骤1.取试管5支，编号，按表操作。1234空白0.1mol/LpH10的碳酸盐缓冲液1.01.01.01.01.00.04mol/L底物液1.01.01.01.01.0预温温度放冰浴3min放37℃水浴3min放沸水浴3min酶液冰浴中预冷酶液0.1ml室温下酶液0.1ml蒸馏水0.1ml保温温度放冰浴15min放冰浴15min后立即移至37℃水浴15min放37℃水浴15min放沸水浴15min后立即移至37℃水浴15min放37℃水浴15min第8页,共19页，星期六，2024年，5月2.各管保温后，立即加入碱性试剂1.0ml以终止反应。3.各管中分别加入0.3%4-氨基安替比林液1.0ml及0.5%铁氰化钾2.0ml充分混匀，室温放置10min，以空白管校正零点，不比色,用+来表示颜色的深浅.第9页,共19页，星期六，2024年，5月底物浓度对酶活性的影响实验原理1913年，Michaelis和Menten提出了酶促反应速度和底物浓度的关系式，即米氏方程。

V＝Vm×[S]/(Km+[S])式中：

V为反应初速度

Vm为最大反应速度

[S]为底物浓度

Km为米氏常数Km值是酶的一个特征性常数，可近似表示酶与底物的亲和力。双倒数作图法是用实验方法测定Km值的最常用的方法。第10页,共19页，星期六，2024年，5月双倒数作图法。1Km11???=??????+??VVmax[S]Vmax取米氏方程式的倒数形式：1/Vmax斜率=Km/Vm