测定核酸含量的几种方法.ppt

CompanyLogoCompanyLogo关于测定核酸含量的几种方法核酸由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，为生命的最基本物质之一。核酸广泛存在于所有动植物细胞、微生物内、生物体内的核酸常与蛋白质结合形成核蛋白。不同的核酸，其化学组成、核苷酸排列顺序等不同。根据化学组成不同，核酸可分为核糖核酸（简称RNA）和脱氧核糖核酸（简称DNA）。第2页,共12页，星期六，2024年，5月为什么要测核酸含量有助于接下来核酸相关实验中所用酶和其他试剂含量的确定为了排除核酸在实验中的干扰第3页,共12页，星期六，2024年，5月核酸含量测定的几种方法定磷法定糖法紫外吸收法荧光光度法第4页,共12页，星期六，2024年，5月定磷法在酸性环境中，定磷试剂中的钼酸铵以钼酸形式与样品中的磷酸反应生成磷钼酸，当有还原剂存在时磷钼酸立即转变蓝色的还原产物——钼蓝钼蓝最大的光吸收在650—660nm波长处。当使用抗坏血酸为还原剂时，测定的最适范围为1—10微克无机磷。测定样品核酸总磷量，需先将它用硫酸或过氯酸消化成无机磷再行测定。总磷量减去未消化样品中测得的无机磷量，即得核酸含磷量，由此可以计算出核酸含量。优缺点：简单，快速，灵敏度高，但是受蛋白质和核苷酸的影响第5页,共12页，星期六，2024年，5月注意事项1）清洗实验用容器不要用含磷清洗剂2）消化过程注意防止爆沸和溅出内容物第6页,共12页，星期六，2024年，5月定糖法核酸中的戊糖可在浓盐酸或浓硫酸作用下脱水生成醛类化合物，醛类化合物可与某些成色剂缩合成有色化合物，可用比色法或分光光度法测定其溶液中的吸收值，在一定浓度范围内，溶液的吸收值与核酸的含量成正比。1、核糖的测定生成的绿色化合物在λ=670nm处有最大的吸收值。2、脱氧核糖的测定DNA中的脱氧核糖可在浓硫酸作用下脱水生成ω-羟基-γ-酮戊酸，该化合物可与二苯胺生成兰色化合物，在λ=595nm处有最大吸收值。优缺点：较灵敏，但特异性较差，凡戊糖均有此反应。第7页,共12页，星期六，2024年，5月注意事项其他糖及糖的衍生物、芳香醛、蛋白质等都对实验有干扰，测定前应尽量可能除去。第8页,共12页，星期六，2024年，5月紫外吸收法组成核酸分子的碱基，均具有一定的吸收紫外线特性，最大吸收值在波长为250~270nm之间。核酸的最大吸收波长是260nm，这个物理特性为测定核酸溶液浓度提供了基础。在波长260nm紫外线下，1OD值的光密度相当于双链DNA浓度为50μg/ml；单链DNA或RNA为20μg/ml。可以次来计算核酸样品的浓度。优缺点：只用于测定浓度大于0.25μg/ml的核酸溶液第9页,共12页，星期六，2024年，5月荧光光度法即琼脂糖凝胶电泳法。溴化乙锭在紫外光照射下能发射荧光，它插入到DNA分子中形成荧光结合物，使发射的荧光增强几十倍，而荧光的强度正比于DNA的含量，将已知浓度的标准样品作为电泳对照，就可以估计出待测样品的浓度。用量只需要5-10ngDNA即可，肉眼观察可检测0.05g-0.1g的DNA。该方法只是估计水平，另外还应考虑DNA或RNA样品中分子大小与标准对照中核酸分子的长度。第10页,共12页，星期六，2024年，5月小节根据不同情况以及实验条件选择合适的检测方法。无论何种方法，均需保证待测样品的核酸（DNA或RNA)纯度。根据需要设定一定的平行以及对照。第11页,共12页，星期六，2024年，5月感谢大家观看第12页,共12页，星期六，2024年，5月CompanyLogoCompanyLogo