病理检验技术（第3版）课件 第12章 免疫细胞和组织化学技术 .pptx

免疫细胞和组织化学技术;第一节 概述;第二节免疫荧光组织化学技术;免疫荧光组化技术染色方法分为：

直接法、间接法、补体法和双重荧光标记法。;是免疫荧光组化技术最简单和基本的方法。把荧光抗体(或抗原)滴加于待检标本片上，直接与细胞或组织中相应抗原(或抗体)结合，洗涤后在荧光显微镜下即可见抗原(或抗体)存在部位呈现特异性荧光(图1)。此法常用于细菌、病毒等的快速检查和淋巴细胞表面抗原与受体的鉴定。;间接法;补体法;(二)间接检查组织内抗原法

将新鲜补体与第一抗体的混合液加在抗原标本切片上，经37℃孵育后，如发生抗原抗体反应，补体就结合在抗原抗体复合物上，再用荧光素标记的抗补体抗体与结合的补体反应，形成抗原—抗体—补体—抗补体荧光抗体的复合物。此法的优点是只需一种荧光抗体即可适用于各种不同种属来源的第一抗体。;第三节免疫酶组织化学技术;直接法;间接法;PAP法;双桥PAP法;第四节亲和免疫组织化学技术;ABC技术;SP法;SPA法;第五节免疫组化染色中常见问题及其处理;2.固定

用于免疫组化的固定剂很多，最好根据抗原的耐受性选择相应的固定液，但在临床病理的实际工作中，通常是在常规HE染色后决定是否进行免疫组化染色，固定剂一般都是用4%甲醛液，此时，固定时间最好在12小时以内，否则，随固定时间的延长，组织抗原的检出率会逐渐下降。另外，组织固定后要充分冲洗，去除固定剂，以免固定剂对染色造成影响。;3.脱水、透明、浸蜡

脱水、透明要充分，浸蜡的时间和温度需严格控制，不能过度，否则既影响抗原定位的准确性，又因组织硬、脆而致切片不完整，染色时容易脱片。一般组织块无水乙醇脱水共3步，每步1小时;二甲苯透明15～30分钟;浸蜡及包埋用石蜡温度不超过60℃，常用低熔点的软蜡包埋。;二、制片

(一)载物片的处理

在免疫组化染色中，如果载物片没有处理好，很容易发生脱片。可以根据情况，选择下列一种方法预先处理载物片。

1.多聚左旋赖氨酸

2.明胶硫酸铬钾法

3.氨丙基—乙氧基甲硅烷(APES)法

(二)切片

切片刀要锋利，切成的切片要完整，应无皱褶、无刀痕，否则，染色时可出现假阳性。切片厚度一般在3～5μm，太厚会影响对染色结果的判断，染色时还容易发生脱片。;三、染色

在免疫组化染色过程中，要注意以下几方面的问题。

(一)去除内源性酶及内源性生物素

1.去除内源性

2.去除内源性

3.灭活碱性磷酸酶

(二)抑制非特异性背景着色

非特异性背景着色最常见的情况是抗体吸附到组织中高度荷电的胶原和结缔组织上。为了防止这种情况的发生，最好的办法是用特异性抗体来源的同种动物灭活的非免疫血清在特异性抗体之前进行处理，以封闭荷电点，阻止一抗与之结合。

但一般实验室常用的是2%～10%羊血清或2%牛血清白蛋白，在室温下作用10～30分钟。须注意此种结合是不牢固的，所以不要冲洗，倾去余液后直接加一抗。使用多克隆抗体，更易产生背景着色，在稀释抗体时可使用含1%非免疫血清的pH为7.4的PBS液。

冲洗3分钟，2次。;(三)缓冲液

抗原抗体反应最合适的pH为7.2～7.6。免疫组化最常用的缓冲液是0.01mol/LpH为7.4磷酸盐缓冲液(PBS)，其简易配制方法为:将NaH2PO41g、Na2HPO415.6g、NaCl42.5g分别加入5000ml蒸馏水中即成。若采用AKP作为标记物底物，用0.02mol/LpH为8.2的TBS缓冲液较好。

(四)抗原修复

甲醛在固定组织时会封闭部分抗原决定簇，因此，在染色时，有些抗原需要先进行修复或暴露，以利抗原抗体最大限度地结合，增强特异性染色。目前常用的抗原修复方法有以下几种。

胰蛋白酶法

2.胃蛋白酶法

3.热诱导的抗原修复(HIAR

(1)水浴加热法

(2)微波加热法

(3)高压加热法。;(五)抗体的选用、分装、稀释及保存

抗体是免疫组化技术中最重要的试剂。使用新的抗体前，应该了解其工作浓度范围，还应根据实验室的条件，确定最佳稀释度，以获得最强的特异性染色和最弱的背景染色。

另外，还要注意抗体的保存，防止抗体的效价过快地降低。

抗体的选用

多克隆抗体的抗原专一性较差，非特异性反应较明显，

但其价格低廉，效价较高，

稀释度一般在(1：100)～(1：1000)，适应性强。

单克隆抗体的抗原专一性强，

质量和效价稳定，非特异性反应较少，

但其价格昂贵，效价较低，

稀释度一般在(1：50)～(1：100)。

;2.抗体稀释抗原抗体的结合反应与两者之间的分子比例有密切的关系，如果抗体分子过多，阳性反应反而减弱，