流式细胞术实验方法及应用.ppt

全血或单细胞+刺激素(佛波脂)和阻断剂(莫能霉素)37℃培养4-6h加入细胞表面抗体(如CD3、CD4/CD8)孵育20-30minPBS洗1次加固定破膜剂室温15min加入IFN-r和IL-4抗体孵育30minPBS洗两次FCM。细胞因子检测（IFN-r，IL-4）：第56页,共77页，星期六，2024年，5月结果分析：运用流式设门技术，先利用前向散射（FS）和侧向散射（SS）圈出淋巴细胞，再用CD3+和SSC设门圈出T淋巴细胞，再用CD8-/CD3+设门选定T淋巴细胞亚群，再分析IL-4+和CD4+/IFN-r淋巴细胞T淋巴细胞（CD3+）CD3+CD8-（CD4+）IFN-rIL-4第57页,共77页，星期六，2024年，5月检测Fluo-3/Am是高特异性Ca2+荧光指示剂，能与Ca2+特异结合。Fluo-3它本身是亲水性，不易透过膜的，依赖其脂溶性AM（乙酰氧甲基），酯化后就容易跨过质膜进入胞浆，在胞内酯酶的作用下，脱去AM重新生成亲水性形式，一方面不能再进入细胞器，另一方面易于在胞内扩散，与游离钙离子结合，通过检测其荧光强度可反映出细胞内游离Ca2+浓度的变化。单细胞悬液+flour-3/AM37oC避光孵育40minPBS洗1次上机检测5、细胞内Ca2+浓度

Ca2+超载是细胞损伤的重要标志，导致DNA降解，促使细胞凋亡。第58页,共77页，星期六，2024年，5月6、线粒体膜电位线粒体膜电位（MMP）是线粒体功能的重要参数，是评价线粒体功能的敏感指标，它的大小直接反映线粒体功能及数量，MMP下降，其氧化磷酸化功能障碍，使ATP产生减少，导致细胞凋亡和坏死。第59页,共77页，星期六，2024年，5月Rhodamine123（罗丹明123）、DiOC6、JC-1等多种亲脂性的阳离子荧光素都能被流式细胞分析用于作为检测MMP的探针。这些亲脂性荧光染料，对膜具有通透性，另外线粒体内外膜之间存在着跨膜电位，线粒体内膜的内侧带负电荷，当它们与活细胞一起培养时，这些阳离子荧光素进入细胞内就能特异地聚集于线粒体，其摄入量与线粒体膜电位成正比。MMP检测原理及方法：第60页,共77页，星期六，2024年，5月当MMP降低后，线粒体内的荧光素会发生外漏，在细胞内荧光强度降低。检测其荧光强度能反映线粒体数量和MMP的降低或丧失。操作：单细胞悬液（1*106）+1umol/L的Rh12337oC,30minPBS洗两次上机检测第61页,共77页，星期六，2024年，5月细胞凋亡是细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序结束其生命的过程。细胞凋亡为一种可调控的、主动的细胞死亡过程，有很多的促进或抑制凋亡的调控途径存在，因而就可以人为地诱导或抑制某些细胞的凋亡，从而达到防病、治病的目的。7、FCM检测细胞凋亡第62页,共77页，星期六，2024年，5月半胱氨酸蛋白酶（Caspase）以无活性的酶原形式存在细胞内，需被水解加工后才能成为有活性的片段。活化的Caspase进一步激活其他的Caspase前体，形成了级联放大切割过程，是直接导致凋亡细胞解体的蛋白酶系统，目前已发现15个Caspase家族成员，分别命名为Caspase1-15。在Caspase家族成员中，Caspase-3是最重要的指示蛋白酶。（1）Caspase家族第63页,共77页，星期六，2024年，5月操作：单细胞悬液（1*106）固定和破膜剂冰浴20minPerm/WashBuffer洗两次20ul单抗室温孵育30minPerm/WashBuffer洗1次加0.5mlPerm/WashBuffer上机检测。第64页,共77页，星期六，2024年，5月细胞凋亡过程中有多种基因蛋白参与调控。凋亡相关基因可分两类：诱导凋亡基因和抗凋亡基因。主要有bcl-2家族、P53、ced基因家族等。抗凋亡基因:bcl-2、bcl-XL、Bad等促凋亡基因:bax、bak、bcl-XS等染色标记同Caspase（2）凋亡相关基因蛋白第65页,共77页，星期六，2024年，5月Fas又称APO-1，即CD95分子，是细胞膜上的跨膜蛋白，表达在各种组织细胞，是典型的细胞死亡受体。Fas/FasL是凋亡诱导家族的重要成员之一，是调节组织发育和体内平衡的