质粒提取和酶切分析ppt课件.pptxVIP

;质粒DNA的限制性内切酶酶切分析;;;;;1)寄主控制的限制与修饰现象;2)限制性核酸内切酶的类型及特性

按限制酶的亚基组成和切断核酸情况的不同，分为三类：

Ⅰ型

Ⅱ型*

Ⅲ型;第一类（I型）限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，它们在识别位点很远的地方任意切割DNA链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。这类限制性内切酶在DNA重组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析DNA结构或克隆基因。这类酶如EcoB、EcoK等。;第二类(II型)限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链。由于这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的。因此，这种限制性内切酶是DNA重组技术中最常用的工具酶之一。

这种酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是4个或6个核苷酸，少数也有识别5个核苷酸以及7个、8个、9个、10个和11个核苷酸的。这种酶的切割可以有两种方式：;粘性末端；是交错切割，结果形成两条单链末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘性末端。

如EcoRI的识别顺序为：

5’……G|AATTC……3’

3’……CTTAA|G……5’

在双链上交错切割的位置切割后生成

5’……GAATTC……3’

3’……CTTAAG……5’

各有一个单链末端，二条单链是互补的，其断裂的磷酸二酯键以及氢键可通过DNA连接酶的作用而“粘合”。;II型酶切割方式的另一种是在同一位置上切割双链，产生平头末端。例如EcoRV的识别位置是：

5’……GAT|ATC……3’

3’……CTA|TAG……5’

切割后形成

5’……GATATC……3’

3’……CTATAG……5’

这种末端同样可以通过DNA连接酶连接起来。;

异源同工酶：又称同裂酶有时两种限制性内切酶的识别核苷酸顺序和切割位置都相同，这些有相同切点的酶称为同裂酶（或同切酶）。

同裂酶差别只在于当识别顺序中有甲基化的核苷酸时，一种限制性内切酶可以切割，另一种则不能。例如HpaⅡ和MspⅠ的识别顺序都是

5’……G|CGG……3’

3’……GGC|G……5’

;有时两种酶切割序列不完全相同，但却能产生相同的粘性末端，这类酶被称为同尾酶

同尾酶??切割产物可以通过DNA连接酶将这类末端连接起来，但原来的酶切位点将被破坏。;如Xba1和Nhe1:

5‘…T|CTAGA…3’5‘…G|CTAGC…3’

3‘…AGATC|T…5’3‘…CGATC|G…5’

5‘…TCTAGA…3’5‘…GCTAGC…3’

3‘…AGATCT…5’3‘…CGATCG…5’

5‘…TCTAGC…3’

3‘…AGATCG…5’

这些粘性末端连接后，Xba1和Nhe1酶将不能再切割，但可以利用Bfa1(酶切识别位点为GATC)来进行再切割。;4)限制性核酸内切酶的命名法

用属名的头一个字母和种名的头两个字母表示寄主菌的物种名称，如E.coli用Eco表示，所以用斜体字。

用一个字母代表菌株或型，如流感嗜血菌(Heamophilusinfluenzae)Rd菌株用d，即Hind。

如果一种特殊的寄主菌株，具有几个不同的限制与修饰酶，则以罗马数字表示，如HindⅠ,HindⅡ，HindⅢ等。;3.酶切反应的设计一般应注意问题:

大多数限制酶贮存在50％甘油溶液中，以避免在-20℃条件下结冰。当最终反应液中甘油浓度大于12％时，某些限制酶的识别特异性降低，从而抑制酶活性。因此加入反应的酶体积不超过反应总体积的10%。

反应混合物中基因组DNA底物的浓度不宜太大，小体积中过高浓度的基因组DNA会形成粘性DNA溶液,从而抑制酶的扩散，并降低酶活性。建议酶切反应的基因组DNA浓度为0.1-0.4ug/ul。同时RNA应该尽量消化去除。

当要用两种或两种以上限制酶切割DNA时，必须选择好通用缓冲液，则两种酶才可同时切割。;酶切底物DNA应具备一定的纯度，其溶液中不能含有迹量酚、氯仿、乙醇，大于10mM的EDTA，SDS以及过量的盐离子浓度，否则会不同程度地影响限制酶的活性。

反应混合液中加入浓度为0.1mg/ml的BSA，可维持酶的稳定性。

酶单位定义:

活性单位：在最适反应条件下(温度、PH值、离子浓度）1小时内完全酶切1μg特定DNA底物所需的限制酶的量。

;4.酶切实验中的注意事项:

反应取酶时应使用无菌吸头，以免污染酶液，同时应尽量缩短酶在温室