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蛋白质含量测定方法介绍

Bradford方法1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法

(Bradford法)，是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白

质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应

用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。

一、原理：考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，

使染料的最大吸收峰的位置(lmax)，由465nm变为595nm，溶液的

颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱

性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合，在595nm下测

定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。Bradford法的突出优点

是:(1)灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可

达1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质

-染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比

Lowry法要大的多。(2)测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个

样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大

约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分

钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那

样费时和严格地控制时间。(3)干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、

Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA

等均不干扰此测定法。此法的缺点是:(1)由于各种蛋白质中的精氨酸和

芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有

较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用球蛋白为标准蛋白质，以减

少这方面的偏差。(2)仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质

有:去污剂、TritonX-100、十二烷基硫酸钠(SDS)和0.1N的NaOH。

(如同0.1N的酸干扰Lowary法一样)。(3)标准曲线也有轻微的非线性，

因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质

的浓度。

二、试剂与器材1.试剂:(1)标准蛋白质溶液，用球蛋白或牛血清清

蛋白(BSA)，配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的标准蛋白质溶液。(2)

考马斯亮兰G-250染料试剂:称100mg考马斯亮兰G-250，溶于50ml

95%的乙醇后，再加入120ml85%的磷酸，用水稀释至1升。2.器

材:(1)可见光分光光度计(2)旋涡混合器(3)试管16支

三、操作方法1.标准方法(1)取16支试管，1支作空白，3支留作

未知样品，其余试管分为两组按表中顺序，分别加入样品、水和试剂，

即用1.0mg/ml的标准蛋白质溶液给各试管分别加入:0、0.01、0.02、

0.04、0.06、0.08、0.1ml，然后用无离子水补充到0.1ml。最后各试

管中分别加入5.0ml考马斯亮兰G-250试剂，每加完一管，立即在旋

涡混合器上混合(注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除)。未

知样品的加样量见下表中的第8、9、10管。(2)加完试剂2~5分钟后，

即可开始用比色皿，在分光光度计上测定各样品在595nm处的光吸收

值A595，空白对照为第1号试管，即0.1mlH2O加5.0mlG-250试

剂。注意:不可使用石英比色皿(因不易洗去染色)，可用塑料或玻璃比

色皿，使用后立即用