人感染H7N9禽流感病毒PCR检测操作程序.pdfVIP

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医院人感染禽流感病毒核酸检测

标准操作程序

一、目的

确保人感染禽流感病毒核酸检测过程标准化、规范化，

降低人为不规范操作对检测结果造成的影响，保证结果的准

确性和可重复性。

二、适用范围

医疗机构临床基因扩增检验实验室按照《关于医院开展

人感染禽流感病毒核酸检测有关工作的通知》（卫办医政函

〔〕号）和《关于做好医疗机构人感染禽流感检测试剂供给

保障工作的通知》（卫发明电〔〕号）有关要求，使用国家

疾病预防控制中心制备或商品化试剂盒开展人感染禽流感

病毒核酸检测工作。

三、样本采集、运送和保存

尽量采集病例发病早期的呼吸道样本(上呼吸道样本包

括咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物、咽漱液和鼻洗液,下呼吸

道样本包括痰液、气管吸取物、肺洗液、肺组织等)。可将鼻、

咽拭子收集于同一采样管中，以便提高检出率。患者有下呼

吸道样本时，应优先采集。

根据试剂说明书对样本采集方法有关要求，制订样本采

集标准操作程序（），并组织样本采集人员进行培训及考核。

样本的采集应当严格按照进行。

样本采集后，按照《人间传染病的病原微生物名录》中

高致病性禽流感病毒的相关规定进行包装，用密封容器立即

送往实验室。若气温高时，需放入冰块降温。样本抵达实验

室后，应尽快进行检测，小时内能检测的样本可置于～℃暂

时保存，小时内无法检测的样本则应置于≤-70℃状态保存。

如无-70℃保存条件时，可于-20℃冰箱暂存。样本避免反复

冻融。

样本采集、处理、运输及保存不当时，可因病毒降解出

现假阴性结果，也可因为样本“污染”出现假阳性结果。

四、检测

（一）样本处理

样本的核酸提取应当在样本处理区进行。按所采用的商

品化试剂盒说明书要求，取适量待检样本、阳性及阴性对照

进行核酸提取。样本应尽可能新鲜，提取过程应严防酶污染

及操作不当导致的降解。提取过程如涉及离心步骤，应采用

低温冷冻离心机；在生物安全柜内进行加样、提取过程中，

为防止降解，可将试管架置于托盘内平铺的碎冰上。提取好

的应及时用于检测，否则应当-70℃保存。如无-70℃保存条

件，可于-20℃冰箱暂存。

（二）试剂准备

试剂准备应当在试剂准备区进行。根据所用的试剂盒，

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样本可进行甲型流感病毒核酸、禽流感亚型或病毒核酸的检

测。试剂的配制按所用商品化试剂盒说明书进行。除酶混合

物外，其它试剂在使用前应当在室温充分复融，混匀并瞬时

低速离心。反应液分装时尽量避免产生气泡，上机前注意检

查各反应管是否盖紧，以免管内溶液泄露污染仪器。分装有

扩增反应液的反应管应当扣盖或装入密实袋内再转移至样

本处理区。

（三）加样

加样应当在样本处理区进行。加样时应当使样品完全落

入反应液中，不应有样品粘附于管壁上，加样后应尽快盖紧

管盖。

按试剂、仪器说明书完成加样和反应管准备。

（四）扩增检测

扩增检测在扩增区进行。待检管转移至扩增区，按顺序

置于仪上，编辑样本信息，按试剂和仪器说明书设定循环参

数。

（五）结果分析

根据所用试剂盒说明书设置基线值（）。荧光阈值（）

设定以阈值线刚好超过阴性对照品扩增曲线（无规则的噪音

线）的最高点为原则，且值应大于所设置的扩增循环数（或

显示为）。使用仪器配套软件自动分析结果。

（六）质量控制

检测过程对可能出现的假阳性和假阴性进行质量控制，

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除了检测商品试剂盒所提供阳性和阴性对照外，每次临床样

本检测时，至少应当有份弱阳性和份阴性质控样本（多份阴

性质控样本设置对实验室“污染”所致假阳性的监控更为有

效），随机放在所检测标本的中间。弱阳性质控样本可为检

测阳性的灭活稀释后保存的临床样本、灭活病毒或假病毒颗

粒等，如所采用的商品化试剂盒有“内标”控制假阴性，或

弱阳性质控样本来源困难，可暂不设弱阳性质控。阴性质控

样本采用标本采集管内溶液即可。质控样本应与临床标本同

等对待，参与样本核酸提取和扩增检测全过程。

试剂盒中的阳性和阴性对照用于判断实验室的有效性，

按试剂盒说明