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水生动物细菌性病原检测技术规范

1范围

本标准规定了水生动物细菌性病原（Bacterialpathogensofaquaticanimals）检测的试剂与材料、仪器设备、采样、细菌性病原分离培养和病原菌检测。

本标准适用于山东省水生动物常见细菌性病原检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB4789.28食品安全国家标准食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求SC/T7014—2006水生动物检疫实验技术规范

SC/T7201.1鱼类细菌病检疫技术规程第1部分：通用技术

SN/T2123出入境动物检疫实验样品采集、运输和保存规范

3试剂与材料

试剂与材料应符合GB4789.28和附录A的规定。

4仪器设备

按照SC/T7201.1的规定执行。

5采样

5.1采样用具

应使用无菌采样用具。

5.2采样数量、个体要求、采集部位

按照SC/T7014—2006中第6章的规定执行。

5.3样品运输及保存

按照SN/T2123的规定执行。

6细菌性病原分离培养

6.1分离培养

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6.1.1兼性厌氧菌和需氧菌的分离培养

规范取样后，采用稀释倒平板法、涂布平板法、平板划线法等方式，在28℃~30℃培养24h；低温下取样应在15℃~18℃同步培养24h。

6.1.2厌氧菌的分离培养

将处理好的平板置于玻璃干燥器，并在其上方放置连二亚硫酸钠和无水碳酸钠（分别研细均匀，临用前混合置于一平皿内）各30g/1000mL容积，然后将干燥器盖严，用凡士林密封，在28℃~30℃培养24h；低温下取样则应在15℃~18℃同步培养24h。

严格厌氧菌的分离培养应在厌氧工作台中进行。

6.2纯培养

6.2.1兼性厌氧菌和需氧菌的纯培养

挑取单菌落，接种于相应培养基上，按照6.1.1的方法培养。

6.2.2厌氧菌的纯培养

挑取单菌落，接种于相应培养基上，按照6.1.2的方法培养。

6.3多次纯培养

若经过纯培养后，未能得到形态特征基本一致的单菌落，可进行多次纯培养，直到获得形态特征基本一致的单菌落，操作步骤应符合6.2的要求。

7病原菌检测

7.1病原菌16SrDNA序列分析

7.1.1菌落PCR

按照附录B执行。

7.1.2结果判定

7.1.2.1PCR结果可靠

DNAMarker标准样品出现清晰的梯度条带，阳性对照可见1472bp左右DNA条带，且阴性和空白对照样品无条带出现，则PCR实验结果可靠，可进行样品分析。

7.1.2.2电泳失败

DNAMarker标准样品未出现条带，则电泳失败，应检查电泳试剂重新进行电泳。

7.1.2.3检测结果无效

DNAMarker标准样品出现清晰的梯度条带，阳性对照无条带或者DNA条带非1472bp左右，或者在阴性对照和空白对照样品中出现了DNA条带，则试验结果无效，应重新进行PCR扩增。

7.1.3克隆、测序和比对

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将7.1.2样品扩增条带克隆、测序，序列输入到NCBI网站进行比对，确定细菌的属种。

7.2病原菌生化特性检测

按照SC/T7014—2006中的9.4规定执行。

7.3结果综合判定

需要鉴定病原菌到属依据7.1.3结果进行判定，需要进一步鉴定到种应结合7.2结果进行综合判定。

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附录A

（规范性附录）

试剂的配制

A.1TE缓冲液

A.1.1A液：1mol/LTris·HCl(pH8.0)

称取Tris碱6.06g，加去离子水40mL溶解，滴加浓HCl约2mL调pH至8.0，定容至50mL。

A.1.2B液：0.5mol/LEDTA(pH8.0)

称取Na2EDTA·2H2O9.31g，加超纯水35mL，剧烈搅拌，用约1gNaOH颗粒调pH至8.0，定容至50mL（Na2EDTA·2H2O需加入NaOH将pH调至接近8.0时才会溶解）。

A.1.3TE缓冲液

量取A液5mL，B液1mL于烧杯中，加400mL去离子水混合，调pH至8.0，定容至500mL。

A.21×TAE缓冲液

称取Tris242.0g，Na2EDTA·2H2O37.2g于1L烧杯中，加800mL去离子水充分搅拌溶解，再加入57.1mL醋酸，充分混匀。最后以去离子水定容至1000mL即为50×TAE缓冲液，使用时稀释50倍即可。

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附录