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食用菌病害检测鉴定方法

1范围

本文件明确了食用菌病害的检测鉴定方法。

本文件适用于国内生产和进口的各类食用菌中真菌病害、细菌病害和病毒病害的检测鉴定。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅注日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB/T12728食用菌术语

GB19489实验室生物安全通用要求

GB/T27402实验室质量控制规范植物检疫

GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测

3术语、定义和缩略语

3.1术语和定义

GB/T12728界定的术语和定义适用于本文件。

3.2缩略语

下列缩略语适用于本文件。

Ct：循环阈值（Cyclethreshold）

CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（CetyltrimethylammoniumBromide）DNA：脱氧核糖核酸（DeoxyribonucleicAcid）

NCBI：美国生物技术信息中心（NationalCenterforBiotechnologyInformation）OD：光密度（OpticalDensity）

PCR：聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction）

PDA：马铃薯葡萄糖琼脂（PotatoDextroseAgar）

RNA：核糖核酸（RibonucleicAcid）

RT-PCR：反转录聚合酶链式反应（ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction）

4总体要求

根据病害种类的不同，一般根据形态学特征、分子生物学特征、致病性特征、生理生化特征等进行种类鉴定，需采用多种检测方法综合进行结果判定。

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在整个试验操作过程中应采用安全有效的防护措施，具体要求应符合GB19489、GB/T27402、GB/T27403中的规定。

5仪器及用具

5.1仪器设备

光照培养箱、高压灭菌器、超净工作台、生物显微镜、高速冷冻离心机、纯水仪、恒温水浴锅、低温冰箱、电子天平、酶标仪、PCR仪、荧光定量PCR仪、电泳仪、电泳槽、凝胶成像分析仪等。

5.2用具

培养皿、烧杯、酒精灯、微型解剖刀、解剖针、吸管、标签、指形管、镊子、放大镜、载玻片、盖玻片、记号笔、可调式微量进样器（2μL、10μL、20μL、100μL、200μL、1000μL）及相应的进样枪头、研钵、离心管（1.5mL、10mL）、PCR管（0.2mL）、量筒、烧杯等。

5.3试剂

无水乙醇、75%酒精、无菌水、商品化核酸提取试剂盒、PCR反应预混液、琼脂糖、生理盐水、培养基、电泳缓冲液、结晶紫、番红、七叶灵、柠檬酸铁、L-色氨酸、酸水解酪素、果糖、纤维二糖、L-苯丙氨酸、柠檬酸钠、酒石酸钾、三水合乙酸铅、D-半乳糖等。

除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水应符合GB/T6682中的要求。

6现场取样

尽量从不同部位多点取样，仔细观察取回的样品，看表面是否有腐烂、斑点、变色、异味、畸形等症状，如发现上述异常，应将样品送实验室鉴定。常见重要食用菌病害病状描述见附录A。

7实验室鉴定

7.1形态学鉴定

7.1.1真菌病害

用接种针或刀片挑取适量寄主发病处的疑似病原菌菌丝，或取分离纯化后生长4-6天的病原菌平板培养物用接种针或刀片挑取适量菌丝，在普通光学显微镜下观察病原菌的形态特征。随机选取10-15个视野，测量并观察病原菌无性态，如分生孢子器、分生孢子等，以及有性态，如子囊壳、子囊孢子等的大小，形态、颜色等，并进行数码显微拍摄，并对测量数值进行记录，一般在10×20、10×40放大倍数下进行观测。对于分离培养的病原菌，同时观察菌落的形态、颜色变化等，并拍照留存。根据权威专著、文献等参考资料，对病原菌进行种类鉴定，以明确病原菌的分类地位。

真菌的分离、纯化及保存方式见附录B。

7.1.2细菌病害

将食用菌发病部位剪成小块（约0.2cm×0.2cm）进行分离纯化，借助光学显微镜观察病原菌的形态特征。对于细菌病害，要对其进行染色，观察其菌体；还可以通过各种染色方

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法观察其是否具有鞭毛、荚膜等，具体方法见附录C。对所观察的形态特征进行拍照留存，根据权威专著、文献等参考资料，对病原菌进行种类鉴定，以明确病原菌的分类地位。

细菌的分离、纯化及保存方式见附录B。

7.1.3病毒病害

对于病毒病害，借助电子显微镜观察其形态特