酶标抗体制作.pdf

原理：利用交联剂合成抗体—交联剂—HRP复合物

HRP标记抗体的方法

酶与抗体交联的方法有许多种,根据酶的结构不同可采用不同的方法。对于制备HRP结

合物，可用戊二醛二步法和过碘酸钠法。尤以简易过碘酸钠法更为常用。

戊二醛二步法

1.原理：戊二醛为一种双功能试剂，通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共价

结合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白结合物。

2.标记步骤：

(1)称取HRP25mg溶于1.25%戊二醛溶液中，于室温静置过夜。

(2)反应后的酶溶液经SephadexG-25层析柱，用生理盐水洗脱。流速控制在1ml/1分

钟，收集棕色流出液。如体积大于5ml，则以PEG浓缩至5ml。放置25ml小烧杯中，缓慢

搅拌。

(3)将待标记的抗体12.5mg用生理盐水稀释至5ml，搅拌下逐滴加入酶溶液中。

(4)用1MPH9.5碳酸缓冲液0.25ml，继续搅拌3?小时。

(5)加0.2M赖氨酸0.25ml，混匀后，置室温2小时。

(6)在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1小时。

(7)3000rpm离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少

量0.15MPH7.4的PBS中。

(8)将上述溶液装入透析袋中，对0.15MPH7.4的PB缓冲盐水透析，去除铵离子后(用

萘氏试剂检测)，10,000rpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保

存。

3.结果判定：

(1)定性及效价滴定：用特异性抗原(或抗体)同酶标记抗体(或抗免疫球蛋白抗体)作双

向琼脂扩散试验或免疫电泳试验。然后用酶的底物使沉淀弧显色，可初步鉴定其活性。最后

以直接ELISA法(或在正式实验系统里)对酶结合物进行滴定(见本节(三)工作浓度的选

择)。

(2)定量和克分子比值测定：可用分光光度计测定(光程1cm)。

酶量(mg/ml)=OD403nm×0.4

IgG量(mg/ml)=OD280nm-OD403nm×0.42)×0.94×0.62

酶量(mg/ml)IgG量(mg/ml)酶量

克分子比值=────────÷───────=───×4

40,000160,000IgG量

(3)本法标记步骤比较简单，重复性好。缺点是酶的利用率低，一般只有2～4%的酶

与蛋白质结合。

4.试剂及器材：

(1)0.1MPH6.8磷酸缓冲盐水(PBS)：取0.2MNa2HPO449ml,0.2MNaH2PO451ml，

NaCl1.8克，加蒸馏水至200ml。

(2)1.25%戊二醛液：取25%戊二醛50ml与PH6.8的PBS1ml混合。

(3)1MPH9.5碳酸盐缓冲液：取1M碳酸钠3ml与1M碳酸氢钠7ml混合。

(4)0.2M赖氨酸溶液：称赖氨酸29.2mg溶于0.01MPH9.5碳酸缓冲液1ml中。

(5)0.15MPH7.4PBS及生理盐水。

(6)PH7.8饱和硫酸铵溶液及半饱和硫酸铵溶液。

(7)萘氏试剂及聚乙二醇(PEG，MW2000)。

(8)纯化的特异性抗体或抗Ig抗体。

(9)HRP(RZ3.0)。

(10)SephadexG-25层析柱(2cm×50cm)。

(11)搅拌器，分光光度计，离心机。

(12)透析袋，大、小烧杯，试管，吸管等。

简易过碘酸钠法

本法是以NaIO4先将HRP表面的糖分子氧化成醛基，然后再与Ig上的氨基相结合，所

获酶标记抗体的产率高，将近70%的HRP和Ig结合，99%的Ig与酶结合，酶与Ig的活性

无重大损失，是目前最常用的方法。

1.原理：经典的过碘酸钠法中需采用二硝基氟苯封闭HRP上残留的α-和ε氨基基以

避免酶分子之间的交联。后来