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实验十
流感病毒的分离鉴定（二）1、血细胞凝集实验2、血细胞凝集抑制试验目的：熟悉病毒血凝、血凝抑制试验的方法及其应用。原理：流感病毒颗粒表面有血凝素,具有使鸡、豚鼠等血细胞凝集的能力。把一定浓度的鸡红细胞加到待检的鸡胚尿囊液或羊水中，如出现血细胞凝集现象，即表示有病毒存在；如血凝阳性，则可进一步用血凝抑制试验进行病毒鉴定，流感病毒的血凝性，可被免疫血清中的特异性抗体所抑制，使其失去凝集作用，借此可用已知抗体鉴定未知病毒及病毒的型、亚型。实验材料接种流感病毒的鸡胚。质量分数为0．5％的鸡红细胞悬液。流感病毒型与亚型免疫血清。碘酒，酒精消毒棉球。灭菌的镊子、剪刀。无菌小试管，毛细滴管，吸管。生理盐水。试管、试管架。实验方法：血细胞凝集实验收获尿囊液：鸡胚孵育3d后,放4度冰箱过夜,次日取出鸡胚,消毒气室端卵壳,用小镊子在无大血管处撕破卵膜,以无菌毛细管吸取尿囊液,放入无菌试管中。取尿囊液0．1mL,作1：10稀释。取10支小试管，按给各管加入生理盐水0.2mL。取1：10稀释的尿囊液0．2mL，加人第1个试管中，混匀后，再吸出0．2mL加入第2个试管中；混匀后，从第2个试管吸出0．2mL加入第3个试管……依次作倍比稀释至第九管，混匀后自第9个试管中取出0．2mL弃掉。这样各管液体量均为0．2mL，从第1-9个试管的尿囊液稀释度为1:20，1:40，…，1:5120，第10个试管为生理盐水对照管。稀释完毕后加人体积分数为0．5％的压积鸡红细胞悬液，每管0．2mL,室温放置30~60mn。010302流感病毒血凝试验试管号12345678910生理盐水0.20.20.20.20.20.20.20.20.20.2病毒液(1:10)0.20.20.20.20.20.20.20.20.2弃0.2病毒稀释度1:201:401:801:1601:3201:6401:12801:25601:5120对照0.5%鸡红细胞0.20.20.20.20.20.20.20.20.20.2摇匀置室温60～90分钟结果++++++++++++++++++++－－－结果观察01观察时要轻拿、勿摇，首先观察对照管应无凝集，然02后再观察试验管，各管出现的凝集程度以“++++”、“+++”、“++”、“+”、“—”表示，判断标准如下：03“++++”：全部红细胞凝集，凝集的红细胞铺满管底，边缘不整齐。04“+++”：大部分红细胞凝集，在管底铺成薄膜状，但尚有少数红细胞不1凝，在管底中心形成小红点。2“++”：约有半数红细胞凝集，在管底铺成薄膜，面积较小，不3凝集的红细胞在管底中心聚成小圆点。4“+”：只有少数红细胞凝集，不凝集的红细胞在管底中心聚成小5圆点，凝集的红细胞在小圆点的周围。6“—”：不凝集，红细胞沉于管底，呈一边缘整齐的致密圆点。7*
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