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皮肤活检组织中分枝杆菌荧光实时PCR鉴定方法的建立

【摘要】目的建立快速鉴定皮肤活检组织中分枝杆菌的荧光实时PCR方法并进

行验证。方法自行设计针对分枝杆菌属和14种常见分枝杆菌的引物探针，建

立分枝杆菌的荧光实时PCR检测体系和方法。利用12株分枝杆菌标准菌株对该

方法进行体外验证，并对2019年至2021年北京大学第一医院皮肤性病科收集的

119例临床诊断皮肤分枝杆菌感染患者的组织样本进行检测。结果体外检测显

示该方法对12种分枝杆菌标准株均有良好的检测敏感性和特异性。在119例临

床诊断分枝杆菌皮肤感染患者活检标本中，培养阳性率仅为21.0%（25/119）；

荧光实时PCR检测分枝杆菌阳性率为76.5%（91/119），其中，44.5%（53/119）

鉴定至菌种水平，以海分枝杆菌为主；31.9%（38/119）仅鉴定至分枝杆菌属水

平。结论建立了可在患者皮肤组织样本中高效检测分枝杆菌的荧光实时PCR方

法，但仍有漏诊可能，还需结合其他分子诊断方法提高敏感性和特异性。

【关键词】分枝杆菌感染；皮肤活组织检查；荧光实时PCR；分枝杆菌属；培养

技术

皮肤分枝杆菌感染临床表现不典型，易与肿瘤和其他细菌、真菌、寄生虫等

慢性感染混淆，且临床易被忽略。同时，不同地区常见致病菌种存在差异，我国

非结核分枝杆菌（nontuberculousmycobacteria，NTM）感染率已超过结核分枝

杆菌（M.tuberculosis，Mtb）［1⁃3］。分子诊断方法已经成为Mtb和NTM

鉴定和分型的重要手段［4］，多基于对培养菌株的鉴定和分型［5］，而基于样

本的分子诊断，多集中于呼吸道分泌物，用于区分Mtb和NTM或者对NTM做进一

步分型，文献报道具有较好的敏感性和特异性［6］。对于皮肤活检标本中分枝

杆菌的检测，均基于活检组织培养阳性菌株，对菌株进行DNA提取及分子鉴定和

分型［1⁃2］，而直接用活检标本提取DNA做Mtb和NTM病原学诊断的报道较少。

由于皮肤活检标本在留作病理检查后的样本量一般很少，培养耗时长且检出率低。

为提高皮肤分枝杆菌检出率，建立快速鉴定皮肤活检组织中分枝杆菌的荧光实时

PCR方法，本研究根据我国报道的分枝杆菌感染的流行情况［7］，针对Mtb、1

3种NTM（慢生长型9种，快生长型4种）设计引物和探针进行荧光实时PCR，

并以12种分枝杆菌标准株、119例患者的皮肤活检组织，对荧光实时PCR检测

方法的特异性和敏感性进行验证。

材料与方法

一、菌株、临床样本及方案设计

1.菌株：12种灭活的标准分枝杆菌菌株包括结核分枝杆菌（M.tuberculosi

s）、海分枝杆菌（M.marinum）、鸟分枝杆菌（M.avium）、堪萨斯分枝杆菌

（M.kansasii）、胞内分枝杆菌（M.intracellulare）、戈登分枝杆菌（M.

gordonae）、马尔摩分枝杆菌（M.malmoense）、苏尔加分枝杆菌（M.szulga

i）、脓肿分枝杆菌（M.abscessus）、偶发分枝杆菌（M.fortuitum）、龟分

枝杆菌（M.chelonae）、耻垢分枝杆菌（M.smegmatis），由中国医学科学院

皮肤病研究所王洪生教授馈赠。

2.临床样本：收集2019年12月至2021年9月在北京大学第一医院皮肤性

病科门诊就诊且临床疑诊皮肤分枝杆菌感染患者。临床诊断须符合以下标准：①

临床表现疑诊皮肤分枝杆菌感染；②组织病理学表现为感染性肉芽肿（包括结核

性肉芽肿或结核样肉芽肿）；③经随访抗分枝杆菌药物治疗有效。为明确诊断，

无菌环境下行皮损部位组织活检，将活检组织平均分为5份分别用于病理学检查、

细菌培养（由检验科完成，哥伦比亚血琼脂平板）、真菌培养、分枝杆菌培养（由

检验科完成，采用BACTECTMMGITTM960分枝杆菌培养鉴定药敏系统）和组织DNA

提取。本研究经北京大学第一医院医学伦理委员会批准（批准号2018⁃070），

所有患者皮肤活检时均签署知情同意书。

3.方案设计：设计荧光实时PCR引物及探针，提取标准菌株DNA，检测荧光

实时PCR引物及探针灵敏性及特异性。收集临床疑诊皮肤分枝杆菌感染患者活检

组织样本，提取DNA并即时进行实时荧光PCR检测。最终收集符合纳入标准患者

的组织病理