病毒性传染病实验室诊断技术进展.pptxVIP

病毒性传染病实验室诊断技术进展;主要内容：;病原学检测常用的实验室技术;分子生物学诊断技术方法简介;分子诊断技术方法简介;分子诊断技术方法简介;分子诊断的功能及扩展;分子诊断的功能及扩展;分子诊断的功能及扩展;分子诊断的功能及扩展;分子诊断的功能及扩展;分子诊断的功能及扩展;耐药病原的分子诊断;血制品筛查;在基础研究领域中的应用；

遗传病的基因诊断和产前基因诊断：

如血友病、地中海贫血等

肿瘤基因和肿瘤标志物表达(mRNA)的检测；

骨髓移植、器官移植供体配型选择；

法医学、动植物学、古人类学、古生物学；

与疾病相关的各种蛋白（细胞因子、酶、激素、受体）的基因表达的检测；

药物基因组学、耐药基因的检测，等等;简单介绍实验原理;;PCR循环

第一步–加热变性;PCR循环

第二步–引物与靶序列退火;PCR循环

第三步-引物延伸;第1个PCR循环完成后;30次循环后靶序列扩增的数量;;;定量PCR测定的是扩增的指数扩增期;

定性PCR测定的是扩增的终点（平台期）;市场上常见的实时荧光PCR仪;临床标本;;NASBA和PCR的不同;乙型肝炎检测标志物：

HBsAg，抗-HBs,

HBeAg，抗-Hbe,

抗HBc(IgG,IgM),

HBV-DNA;乙型肝炎的分子诊断;

2.HBV基因型与血清型关系及流行病学分布

基因型与血清型不完全一致

临床突变率不同

有地域分布特点;表1：;表1(续）:;

3.基因型与临床

实验室表现不同（表2）

病情与转归：C较B差

抗病毒治疗：A优于D

B优于C

adw/ayw20:1;表2:;

4.一般实验室分型方法

测序

PCR-RELP（限制性片断长度多态性）

PCR

核酸杂交（谱线探针法）

血清学：单抗可区分A-F各基因型;

5.抗病毒治疗的耐药性问题

拉米夫定耐药性的检测;拉米夫定耐药性的检测

耐药性与HBV多聚酶基因YMDD氨基酸序列中的核酸变异有关

I型：YMDD变异为HBV聚合酶基因(P区基因)区第741个核苷酸位,A-G置换，使第552个密码子蛋氨酸(M)被缬氨酸(V)取代，成为YVDD变异

II型：YMDD变异为P基因区743个核苷酸的G-T置换，使第55个密码子蛋氨酸(M)被异亮氨酸(工)取代，成为YIDD变异

YMDD变异：Y（酪氨酸）

M（蛋氨酸） V（缬）：YVDD变异

D（天冬氨酸） I（异亮）：YIDD变异

D（天冬氨酸）

最近报道：YSDD（ATG?AGT）

应用拉米夫定耐药位点基因芯片检测突变位点;乙型肝炎的分子诊断;乙型肝炎的分子诊断;HCV的基因型/亚型;HCV基因分型方法;;临床工作;;抗HCV的确认实验

确认的重要性（灰区的遗漏）

目的：解决血液筛查实验（如ELISA）的非特异性问题

方法：例如：

PCR–活动性病毒血症的检测是一个很好的检测方法

RIBA3.0–抗体的确认

新流程：;

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;靶序列来源:

a.单抗检出的TB抗原蛋白编码基因

b.TB特异性核酸片段克隆

c.插入序列;

65KD，165bp;

MPB64，240bp;

IS6110，123bp;

IS986，245bp;

16sDNA，584bp.;?标本处理：痰液化，抑制物去除

?试剂质控及灵敏度;结核的PCR临床主要应用

a.结核与其他分枝杆菌区分

b.结核耐药基因

c.对含菌量低的标本的分离

d.为临床可疑者捕捉信息;?PCR方法与痰涂片及TB培养的比较

应做比对研究;RFP（利福平）

INH（异烟肼）

SM（链霉素）

EMB（乙胺丁醇）

PZA（吡嗪酰胺）

喹诺酮类;单耐药基因检测;同时对利福平、异烟肼这两种或以上的抗结核药物耐药

大多数耐多药菌株是各种药物作用靶分子的编码基因逐步突变所致;靶结构变化与耐药水平有关

少数耐多药菌株是由一个耐多药位点的突变所致;样品的制备

PCR扩增已知的与耐药有关的基因片段

扩增产物耐药基因分析

SSCP（单链构象多态性分析）

RFLP（限制性片段长度多态性分析）

DNA序列分析;需面对的问题;其它需要关注的问题：;演讲完毕，谢