蛋白质下游纯化工艺简介.pdf

以家为家，以乡为乡，以国为国，以天下为天下。——《管子》

蛋白质下游纯化工艺简介

Downstream（下游）与上游相对的概念，一般而言，上游指基因克隆、细胞培养等

目的产物表达工序，下游指从表达有目的产物的复杂的混合液中分离纯化得到符合

要求的目的产物的一系列步骤。美、日、欧等发达国家生物技术产品工业化的实践

证明：生物技术产品的产业化高度依赖于基因工程下游工序技术及设备的进步。

一、纯化工艺常用衔接技术：

1、盐析。常采用硫酸铵、硫酸钠盐析，获得的盐析沉淀物在低温冰箱(-20℃)中

可以长期保存。

2、等电点沉淀。根据蛋白质、多肽在等电点时溶解度最小的特点进行。

3、有机溶剂沉淀。采用冷的丙酮、乙醇沉淀蛋白质。例如人血浆蛋白的乙醇分级

沉淀。

4、透析。根据目的蛋白质、多肽的分子量，选取适宜的透析袋进行透析，可以起

到更换缓冲液以及去除一些低分子杂质的目的。

5、超滤。根据目的蛋白质、多肽的分子量，选取适宜截留分子量(MWcutoff)的超

滤膜进行超滤。

6、真空冷冻干燥。利用在低温和高真空条件下，冰不经融化为液态水而直接升华

为水蒸气的原理。可以很好地浓缩样品和保存蛋白质、多肽的生物活性。

7、变性沉淀。根据目的蛋白质、多肽对于温度或者酸碱性的耐受性，在较高的温

度或者较极端的pH条件下处理样品，使杂质去除的方法。例如胸腺肽制备中使用

的热变性(~80℃)去除杂蛋白。如果目的蛋白、多肽本身热稳定性、酸碱稳定性不

高则不宜采用。

8、离心沉淀。利用离心沉降力将不溶性颗粒物与溶液分离的技术，常采用高速冷

冻离心机进行。

9、脱盐。透析、超滤可用于进行脱盐，SephadexG25、G50常用于蛋白质脱盐。

10、过滤

澄清过滤、除菌过滤（0.22微米膜过滤）、超滤（1000~300000道尔顿）

二、蛋白质、多肽液相色谱纯化方法简介

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chromatography，色谱，层析

表1常用的液相色谱纯化方法及其原理

方法分离原理基于

凝胶过滤（GF）分子大小/形状分子形态

离子交换色谱

分子所带电荷Asp、Glu、Lys、Arg、His等带电氨基酸

（IEX）

疏水作用色谱Trp、Phe、Ile、Leu、Tyr、Pro、Met、al、

表面疏水性

（HIC）Ala等疏水性氨基酸

Trp、Phe、Ile、Leu、Tyr、Pro、Met、al、

反相色谱（RPC）表面疏水性

Ala等疏水性氨基酸

金属螯合色谱分子与金属形成

His、Trp、Cys

（IMAC）配位键

特异生物识别作

亲和色谱抗原-抗体，酶-底物，酶-抑制剂等

用

共价结合色谱共价结合巯基（Cys）

1、纯化的一般目标和方法

首先，自然