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牧草中抗坏血酸的测定测定邻苯二胺荧光法

1范围

本文件规定了新鲜牧草中的抗坏血酸邻苯二胺荧光光度的测定方法。

本文件适用于新鲜牧草中抗坏血酸的测定。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB/T14699.1饲料采样

GB/T20195动物饲料试样的制备

3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4原理

试样L(+)-抗坏血酸经活性炭氧化为L(+)-脱氢抗坏血酸后，与邻苯二胺反应生成有荧光的喹唔啉，其荧光强度与L(+)-抗坏血酸的浓度在一定条件下成正比，以此测定试样中L(+)-抗坏血酸总量。

5试剂和材料

5.1冰乙酸(CH3COOH)：浓度约为30%。

5.2偏磷酸(HPO3)n：含量(以HPO3计)不小于38%。

5.3乙酸钠(CH3COONa)。

5.4硼酸(H3BO3)。

5.5邻苯二胺(C6H8N2)。

5.6酸性活性炭粉：称取约200g活性炭粉（75μm～177μm），加入1L盐酸（1+9），加热回流1h～2h，过滤，用水洗至滤液中无铁离子为止，置于110℃~120℃烘箱中干燥10h，备用。检验铁离子方法：利用普鲁士蓝反应。将20g/L亚铁氰化钾与1%盐酸等量混合，将上述洗出滤液滴入，如有铁离子则产生蓝色沉淀。

5.7偏磷酸-乙酸溶液：称取15g偏磷酸,加入40mL冰乙酸及250mL水，加温，搅拌使之逐渐溶解，冷却后加水至500mL于4℃冰箱可保存7d～10d。

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5.8乙酸钠溶液(500g/L)：称取500g乙酸钠，加入水溶解至1000mL，冷却后，储存于聚乙烯瓶中。5.9硼酸-乙酸钠溶液：称取3g硼酸，用500g/L乙酸钠溶液溶解并稀释至100mL，临用时配制。5.10邻苯二胺溶液(200mg/L)：称取20mg邻苯二胺，用水溶解并稀释至100mL，临用时配制。

5.11抗坏血酸标准品：抗坏血酸（C6H8O6）纯度不小于99%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。

5.12抗坏血酸标准储备液（1000μg/mL）：准确称取适量的抗坏血酸标准物质，用偏磷酸-乙酸溶液（5.7）溶解并配制成（1000μg/mL）的标准储备液，该贮备液在2℃~8℃避光条件下可保存一周。5.13抗坏血酸标准工作液：抗坏血酸标准工作液(100.0μg/mL):准确吸取抗坏血酸标准液10.0mL，用偏磷酸-乙酸溶液（5.7）稀释至100mL，临用时配制。

5.14水为GB/T6682规定的二级水。

6仪器和设备

6.1荧光分光光度计：具有激发波长338nm及发射波长420nm。配有1cm四通比色皿。6.2分析天平：感量0.01mg和0.01g。

6.3组织匀浆机。

7试样制备

按照GB/T14699.1中有关规定采集样品，去杂质后充分混匀，按照GB/T20195制备试样，新鲜样品利用四分法取样后，充分破碎作为分析样品。制备好的试样及时检测。

8测定步骤

8.1提取

称取试样5g～10g（精确至0.01g，取样量视含量而定）于100mL的玻璃烧杯中，用偏磷酸-乙酸溶液（5.7）将其转至100mL的容量瓶中，定容至刻度，摇匀，为样液，另吸取10.0mL抗坏血酸标准工作液（5.13）于100mL的容量瓶中，定容至刻度，摇匀，为标准液，将样液和标准液分别全部转移至200mL具塞锥形瓶中，加入2g活性炭（5.6），用力振摇1min，过滤，弃去最初数毫升滤液，分别收集其余全部滤液，即为试样氧化液和标准氧化液，待测定。

8.2测定

8.2.1分别准确吸取5.00mL试样氧化液于两个50.0mL容量瓶中，作为“试样液”和“试样空白液”。

8.2.2分别准确吸取5.00mL标准氧化液于两个50.0mL容量瓶中，作为“标准液”和“标准空白液”。

8.2.3于“试样空白液”和“标准空白液”中各加2.5mL硼酸-乙酸钠溶液（5.9），混合摇动15min，用水稀释至50.0mL，在4℃冰箱中放置2h～3h，