溶血空斑实验.ppt

关于溶血空斑实验实验目的掌握溶血空斑试验检测原理掌握溶血空斑的操作方法第2页,共17页，星期六，2024年，5月实验原理●溶血空斑实验（plaqueformingcellassay,PFC）体外检测单个抗体形成细胞（B淋巴细胞）的一种方法。●其原理是将绵羊红细胞（SRBC）免疫家兔或小鼠，取家兔淋巴结或小鼠脾细胞制成细胞悬液，与一定量的SRBC结合，在37℃条件下免疫活性淋巴细胞释放出溶血素，在补体的参与下，可溶解周围的绵羊红细胞，从而在每个抗体形成细胞周围形成一个可见的溶血空斑。第3页,共17页，星期六，2024年，5月●一个空斑代表一个抗体形成细胞（即B细胞），空斑的数量反映机体的体液免疫功能。●空斑大小表示抗体生成细胞产生抗体的多少。由于溶血空斑试验具有特异性高，筛选力强，可直接观察等优点，故可用做判定免疫功能的指标，观察免疫应答的动力学变化，并可进行抗体种类及亚类的研究。第4页,共17页，星期六，2024年，5月第5页,共17页，星期六，2024年，5月实验材料与试剂器材：平皿、37℃水浴箱、离心机、显微镜试剂：①SRBC悬液：取无菌脱纤维羊血，用NS或PBS离心洗涤3次，每次以2000rpm，5min，用PH7.2的PBS（含Ca2+、Mg2+）悬成细胞浓度为2.00×109个/mL第6页,共17页，星期六，2024年，5月②Hanks液（含Ca2+、Mg2+）③底层基（1.4%）和表层基（0.7%）：将琼脂糖用Hanks液配成1.4%和0.7%两种浓度。将表层基分装于小试管中，每管2ml④补体：新鲜豚鼠血清⑤小牛血清：56℃灭活30min第7页,共17页，星期六，2024年，5月实验步骤㈠免疫脾细胞悬液的制备①小鼠免疫：每只小鼠经尾静脉注入上述SRBC悬液2.00×104个/0.2ml或者腹腔注射4.00×108?个/1ml。②单个脾细胞悬液的制备：将免疫后第四天的小鼠拉颈处死，解剖取出脾脏，放入PH7.2的PBS中漂洗，去掉结缔组织，加入适量的PBS，用镊子挤压脾脏，稍静置，吸上清液至离心管中，2500r/min离心5min，弃上清后，定量加入PBS液1ml，混匀，再用PBS液稀释10倍（浓度约为5×106个/ml）第8页,共17页，星期六，2024年，5月（二）倾注底层琼脂将1.4%琼脂凝胶加热融化后，倾注于水平位置的平皿内，每皿6ml，凝固后，用前置55℃水浴锅中预温。第9页,共17页，星期六，2024年，5月（三）表层琼脂的制备将0.7%的琼脂融化后，置于55℃恒温水浴箱中，依次加入以下试剂：⑴20%SRBC悬液0.1ml。⑵小牛血清0.1ml。⑶5.00×106/ml脾细胞悬液0.1ml。迅速混匀后，倾注于已铺好底层琼脂的平皿内，使之均匀铺平凝固后，静置约15min，放37℃温育2h。第10页,共17页，星期六，2024年，5月（四）加补体从温箱中取出平皿，每皿加入1:5稀释的新鲜豚鼠血清1ml，继续放37℃温箱中温育30min后取出，观察溶血空斑。也可在室温下放置1h，4℃冰箱过夜，次日观察结果。第11页,共17页，星期六，2024年，5月结果判定?观察时，将平皿对着光亮处，用肉眼或放大镜观察每个溶血空斑的溶血状况，并记录整个平皿中的空斑数，同时求出每百万个脾细胞内含空斑形成细胞的平均数。?第12页,共17页，星期六，2024年，5月注意事项⒈?对SRBC的要求：因为SRBC既是免疫原，也是靶细胞和指示细胞，故要求SRBC应新鲜，洗涤不超过3次，每次2?000r/min离心5min，细胞变形或脆性增大者均不能使用。2．免疫所用SRBC的数量：尾静脉注射以2.00×104?个/0.2ml为宜。腹腔注射为4.00×108?个?/ml，用量小，如低于1.00×107个/ml注射0.5ml，空斑形成极少；用量过大，超过2.50×109个/ml，不能形成空斑。第13页,共17页，星期六，2024年，5月3．采取免疫脾的时间：无论是经尾静脉还是腹腔免疫，均以免疫后第四天取脾为宜，过早或过晚空斑都形成极少。4．脾细胞的活力：?为了保证脾细胞的活力，制备脾细胞过程中所用PBS（或Hank’s液），最好临用时方从4℃冰箱中取出，或整个操作过程应在冰浴中进行。5．倾注平板的要求：底层要平，表层要把握好温度。不要有气泡，表层基要求混合均匀。第14页,共17页，星期六，2024年，5月6．补体的活力：补体活力的大小，对溶血空斑的形成关系很大。如出现抗体或补体的活力低下，将不能形成空斑。所以补体要新鲜，并宜将3只以上豚鼠血清混合。试验中加入Ca2+、Mg2+是为