实时荧光定量PCR技术的原理及其应用.pdf

2018年11月ISSN1672-1438

总第301期CN11-4994/T

实时荧光定量PCR技术的原理及其应用

安钢力

苏州大学唐仲英血液学研究中心江苏苏州215123

摘要：实时荧光定量PCR技术是在定性PCR基础上发展起来的一项新兴技术。通过在PCR反应体系中加入荧光基团，在整

个PCR过程中实时检测产物中荧光信号强度来达到定量的目的。此项技术具有定量准确、特异性强、灵敏度高、操作简便

等优点，越来越受到人们的关注和广泛应用。对实时荧光定量PCR技术原理、分类和应用进行了阐述。

关键词：实时荧光定量PCR；原理；分类；应用

聚合酶链反应(polymerasechainreactionPCR)技前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值

术是20世纪80年代中期发展起来的一项基因检测即一的缺省设置是3～15个循环的荧光信号标准偏差的10

种体外核酸扩增技术。它具有许多优点：特异性、倍。(2)Ct值：C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含

易重复、高效性等，可以在几个小时完成过去几天义是每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经

[2]

或者更长时间完成的实验，因此这项技术在生物医历的循环数。在实时荧光定量PCR中，对全程PCR

学领域具有划时代的意义。但是，传统PCR技术有它扩增过程进行实时检测，根据反应时间和荧光信号的

的缺点，它通过电泳对扩增反应的最终产物进行定性变化可以绘制成一条曲线。一般来说，整条曲线可以

分析而不能对起始模板准确定量，同时也无法对扩增分3个阶段：荧光背景信号阶段、荧光信号指数扩增

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反应实时检测且在实验过程中易污染而出现假阳性。阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光

人们为了寻找更为灵敏、快速、简便、高特异性的方信号与背景无法区分，无法判断产物量的变化。在平

法进行了许多探索研究，直到1996年由美国Applied台期，扩增产物已不再呈指数级的增加，所以反应终

Biosystems公司推出了一种新的定量试验技术—荧产物量与起始模板量之间已经不存在线性关系，通过

光定量PCR(FlurogenicQuantitativePolymeraseChain反应终产物也算不出起始DNA拷贝数。只有在荧光产

Reaction，FQ-PCR；real-timequantitativePCR,RT-生进入指数期，PCR产物量的对数值与起始模板量之

qPCRorqPCR)，它是通过荧光染料或荧光标记的特异间存在线性关系，所以在PCR反应处于指数期的某一

性探针，标记跟踪PCR产物进行实时监测反应，利用点上来检测PCR产物的量，由此来推断模板最初的含

与之相适应的软件对产物进行分析，计算待测样品模量而进行定量分析。研究表明，每个模板的Ct值与该

板的初始浓度，实现了PCR从定性到定量质的跨越，模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数

[4,5]

具有里程碑意义。目前，此项技术已应用于干细胞研越多，Ct值越小。通过已知起始拷贝数的标准品可

究、肿瘤学和遗传疾病研究、病原体检测和传染病研