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肿瘤细胞培养技术课件.ppt

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肿瘤细胞培养技术免疫方法脾内免疫优点:时间短,使用抗原量少。可溶性抗原:2~10?g细胞抗原:1?105缺点:效果差于常规免疫,尤其无基础免疫的脾内免疫。肿瘤细胞培养技术免疫方法脾内免疫方法:BALB/C小鼠乙醚麻醉,右卧位,消毒,无菌操作剪开皮肤,透过腹膜,用4号针头注射器注入脾脏,尽量刺深,勿刺透,纵轴方向,边退边注射或多点注射。注意事项:抗原体积?0.2ml,脾内逐步注射后,针头拔出口时要停留片刻,缝合切口或用医用黏合剂涂抹切口。肿瘤细胞培养技术免疫方法3.弱免疫原免疫方案;0天:基础免疫30天:基础免疫45天:基础免疫60天:基础免疫75天:基础免疫6个月内,至鼠血清测出抗体产生。静脉或脾内追加免疫后72~96h细胞融合。肿瘤细胞培养技术免疫方法4.体外免疫:分离小鼠脾细胞,置10%~20%FCSRPMI1640培基,加适量滋养细胞与抗原(可溶性抗原0.5~5?g/ml;细胞性抗原105~106/ml),37℃,5%CO2培养3天,再分离淋巴细胞与骨髓瘤细胞,融合。肿瘤细胞培养技术单克隆抗体制备一.滋养细胞制备:1.机制:不明,通常认为这类细胞释放一种或几种生长因子,提供必要生长条件。2.小鼠腹腔巨噬细胞制备滋养细胞⑴正常无感染BALB/C小鼠,处死。⑵75%乙醇浸泡5~10min,肿瘤细胞培养技术单克隆抗体制备⑶撕开腹部皮肤,充分暴露腹腔,提起腹膜,剪开,吸管注入5ml无血清培基,小心提动或轻揉腹膜,吸出培基。⑷无血清培基洗2次,细胞浓度2×105/ml,0.1ml/孔/96孔,相当于2×104。通常获2×106~5×106只。肿瘤细胞培养技术单克隆抗体制备二.骨髓瘤细胞准备:Sp2/0,NS-1等1.复苏,20%FCSRPMI-1640培基为好。2.培养、传代,取对数生长期细胞(1×105~5×105/ml),按1:5~1:10稀释传代,2、3天扩大培养,选生长状态、形态好对数生长期细胞融合用。3.RPMI-1640培基洗3次(1000r/min×5min)肿瘤细胞培养技术单克隆抗体制备注意事项:1.骨髓瘤细胞的细胞活数应在〉95%,2.无各种污染,3.骨髓瘤细胞质量保证、生长密度合适。肿瘤细胞培养技术单克隆抗体制备三.免疫脾细胞悬液制备:1.免疫BALB/C鼠,放眼血致死(收集眼血制成血清)。2.浸泡于75%乙醇5~15分,入超净台,打开腹腔(逐次换器械),取脾。3.剪碎脾脏,注射器内芯研磨过100目钢筛,平皿预先2~3mlRPMI-1640,移入圆底试管,补加适量培基,,静置3~5分,取上2/3悬液移入50ml离心管,上述反复2~3次。肿瘤细胞培养技术单克隆抗体制备三.免疫脾细胞悬液制备:5.上述培基洗细胞2次(1000r/min×10min),6.不完全培基10ml重悬液,台盼蓝计数活脾细胞数,1×108~2.5×108/只。肿瘤细胞培养技术单克隆抗体制备四.50%PEG的准备:融合前,称PEG(mw=4000)2g,置小瓶内,低压消毒(8磅),15min,取出立即边加边摇加入2ml完全培基,(内含0.3%ml二甲基亚枫,以提高融合率),至完全混合,4℃保存。用前37℃预热。要求PEG现配,防止PH变碱。肿瘤细胞培养技术单克隆抗体制备五.细胞融合:1.将准备好的骨髓瘤细胞与脾细胞混合于50ml离心管内(脾细胞1×108,骨髓瘤细胞1×107)。用SP2/0时,脾细胞:骨髓瘤细胞以10:1为好;用NS-1,脾细胞:骨髓瘤细胞以5:1为好。肿瘤细胞培养技术单克隆抗体制备2.RPMI-1640培基洗2次(1500r/min/8min);3.倾倒上清,吸尽残留液,轻弹管底,使细胞疏松,离心管移至超净台预先放置的37℃水浴。

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