临床微生物学检验之药敏.pdfVIP

为天地立心，为生民立命，为往圣继绝学，为万世开太平。——张载

临床微生物学检验

一、纸片扩散法

又称Kirby-Bauer(K-B)法，由于其在抗菌药物的选择上具有灵活性，且花费低廉，被WHO

推荐为定性药敏试验的基本方法，已在临床广泛使用。

（一）实验原理

将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸收琼脂

中的水分溶解后不断向纸片周围扩散形成递减的梯度浓度，在纸片周围抑菌浓度范围内测试

菌的生长被抑制，从而形成无菌生长的透明圈即为抑菌圈。抑菌圈的大小反映测试菌对测定

药物的敏感程度，并与该药对测试菌的MIC呈负相关。

（二）培养基和抗菌药物纸片

1、抗菌药物纸片选择直径为6.35mm，吸水量为20µl的专用药敏纸片，用逐片加样或

侵泡方法使每片含药量达规定所示。含药纸片密封贮存2~8℃或-20℃无霜冷冻箱内保

存，β-内酰胺类药敏纸片应冷冻贮存，且不超过一周。使用前将贮存容器移至室温平

衡1~2小时，避免开启贮存容器时产生冷凝水。

2、培养基水解酪蛋白（Mueller-Hinton,M-H）培养基是CLSI采用的兼性厌氧菌和需氧

菌药敏试验标准培养基，pH为7.2~7.4，对那些营养要求高的细菌如流感嗜血杆菌、淋

病奈瑟菌、链球菌等需加入补充物质。琼脂厚度为4mm。配置琼脂平板当天使用或置

塑料密封袋中4℃保存，使用前应将平板置35℃温箱孵育15分钟，使其表面干燥。

（三）实验方法

实验菌株和标准菌株接种采用直接菌落法或细菌液体生长法、用0.5麦氏比浊管标准的菌

液浓度，校正浓度后的菌液应在15分钟内接种完毕。操作步骤如下：

1、接种用无菌棉拭子蘸取菌液，在管内壁将多余菌液旋转挤去后，在琼脂表面均匀涂抹

接种3次，每次旋转平板60度，最后沿平板內缘涂抹一周。

2、贴抗菌药物纸片平板置室温下干燥3~5分钟，用纸片分配器或无菌镊子将含药纸片紧

贴于琼脂表面，各纸片中心相距》24mm，纸片距平板內缘》15mm，纸片贴上后不可再

移动，因为抗菌药物会自动扩散到培养基内。

3、孵育置35℃孵育箱16~18小时后阅读结果，对苯唑西林和万古霉素敏感等应孵育24

小时。

（四）结果判断和报告

用游标卡尺或直尺量取抑菌圈直径（抑菌圈的边缘应是无明显细菌生长的区域），先量取质

控菌株的抑菌环直径，以判断质控是否合格；然后量取试验菌株的抑菌环直径。根据CLSI

标准，对量取的抑菌圈直径作出“敏感”、“耐药”、“中介”的判断。

（五）质量控制

对于肠杆菌科细菌，M-H琼脂，生长法或直接菌落悬液法，相当于0.5麦氏标准的细菌浓

度，35℃+-2℃，空气，16~18小时观察结果，质控菌株推荐为大肠埃希菌ATCC25922，大

肠埃希菌ATCC35218（为监控β-内酰胺酶/β-内酰胺抑制剂纸片用）；对于铜绿假单胞菌

ATCC35218；对于葡萄球菌属细菌，16~18小时观察结果，测苯唑西林、甲氧西林、萘夫西

林和万古霉素需24小时，试验温度超过35℃不能检测甲氧西林耐药葡萄球菌，推荐质控菌

株为金黄色葡萄球菌ATCC25923，大肠埃希菌ATCC35218，纸片扩散法检测葡萄球菌对万

古霉素的敏感性不可靠；对于肠球菌属细菌，16~18小时观察结果，测万古霉素需24小时，

推荐质控菌株为粪肠球菌ATCC29212;对于流感嗜血杆菌和副流感嗜血杆菌，推荐质控菌株

为流感嗜血杆菌ATCC49247，流感嗜血杆菌ATCC