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循环肿瘤DNA的检测方法(中篇).docx

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循环肿瘤DNA的检测方法(中篇)

ctDNA仅占cfDNA的0.1%~5%,且不同癌种、不同病程的肿瘤患者ctDNA在血浆中含量差异较大。因此,需要超敏感方法来检测ctDNA携带的特征信息(包括突变、重排、拷贝数异常、甲基化等)。中篇将介绍ctDNA的各种分析方法。

5.ctDNA的分析方法

循环cfDNA主要由源自正常细胞的种系DNA组成,存在于癌症患者中的ctDNA相对较少且高度可变。因此,传统DNA分析方法(如Sanger测序,焦磷酸测序)的灵敏度不足以检测癌症患者血浆ctDNA中的体细胞突变。

目前ctDNA的分析方法主要有三种:以ARMS为代表的定量PCR技术;以ddPCR为代表的数字PCR技术;基于下一代测序(NGS)的高通量检测技术。近年来也出现了核酸质谱技术和EFIRM技术。

5.1ARMS技术

ARMS全称amplificationrefractorymutationsystem(扩增受阻突变体系),又称等位基因特异性扩增法,是一种在PCR基础上发展起来用于检测DNA中各种点突变的新方法。其基本原理是,如果引物的3′端碱基与模板碱基不互补,则用一般耐热DNA聚合酶无法延伸。因此根据已知点突变设计引物,使3′端碱基分别与突变和正常的模板碱基互补,从而将有某种点突变的模板与正常模板区分开来。ARMS技术结合电泳或荧光定量PCR方法进行检测,前者利用凝胶电泳技术检测扩增带,从而实现结果分析,后者指ARMS技术结合探针对扩增产物进行检测,在荧光定量PCR平台上实现对样品DNA中稀有突变的检测。目前采用电泳分析仍是主流,结合定量PCR的还较少。

四引物ARMS-PCR方法的示意图(该方法基于具有两组引物的PCR反应,通过琼脂糖凝胶电泳进行分析。一组内部引物对于对突变和野生型等位基因是特异性的,并且它们彼此相对设计,另一组外部引物用于在PCR反应中产生对照条带。两个外部引物和内部—外部引物可以相互反应并产生不同长度的产物,它们可以在凝胶电泳中分离。)

资料来源:IranJPublicHealth44(3):380-7,2015,宽华投研团队整理

ARMS技术具有成本低、简便快速、特异性好、技术普及度高等特点,非常适合医院广泛开展。ARMS技术已成为目前欧盟及中国CFDA批准用于临床的血液检测方法,同时获得专家共识的推荐。然而ARMS技术检测灵敏度有限(检测限度为1%),单次只能检测单个基因且只能用于检测已知突变,在一定程度上限制其应用。

艾德生物基于ARMS技术开发了升级版Super-ARMS,其保留了ARMS技术简便快速,特异性好,技术普及度高等特点,非常适合医院广泛开展,同时进一步提高检测灵敏度(0.01-0.2%),满足血液ctDNA检测的要求,更适合作为血液ctDNA检测的临床普及技术。

5.2数字PCR技术

qPCR通过荧光染料或荧光特异性探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时监控反应过程。每扩增一条DNA链,就有荧光染料分子结合到双链DNA上或有荧光分子从探针上释放,实现荧光信号的累积。由于荧光积累与PCR产物形成完全同步,可通过软件对荧光积累信息进行分析和计算,获得待测样品模板的初始浓度。但是,qPCR只能够通过标准曲线和标准品进行相对定量,无法做到精准绝对定量。

qPCR示意图(使用基因特异性引物,通过掺入双链DNA特异性染料或通过聚合酶5-3外切核酸酶活性释放TaqManFRET(荧光共振能量转移)探针检测靶标的初始浓度。)

资料来源:NatRevGenet.2016May17;17(6):333-51,宽华投研团队整理

20世纪末,Vogelstein等提出数字PCR(digitalPCR,dPCR)的概念,与qPCR不同的是,数字PCR可以不需要对照标准样品和标准曲线来实现绝对定量分析。数字PCR一般包括两部分内容,即PCR扩增和荧光信号分析。数字PCR通过将一个样本分成几十到几万份,分配到不同的反应单元,每个单元包含一个或多个拷贝的目标分子(DNA模板),在每个反应单元中分别对目标分子进行PCR扩增,扩增结束后对各个反应单元的荧光信号进行统计学分析。

根据反应单元类型不同,数字PCR分为三类:微反应室/孔板、微流控芯片和微滴数字PCR系统。目前通过数字PCR方法进行ctDNA分析的主要技术有ddPCR和BEAMing。

5.2.1ddPCR

ddPCR全称dropletdigitalPCR(微滴数字PCR)。该技术属于Bio-Rad公司,可实现绝对定量和稀有等位基因的检测,其工作原理为:首先将血浆中分离出的DNA分割成一个个的小微滴,置于不同的微孔中,便于形成多个独立、平行的反应;随后对微孔中的DNA同时进行PCR扩增。在扩增时通过特定的化学试剂和染料探针标记其中的

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