DB22_T 1828-2013 农产品中沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌的多重PCR检测.docxVIP

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DB22

吉林省地方标准

DB22/T1828—2013

农产品中沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌的多重PCR检测

DetectionofSalmonella,ShigellaandStaphylococcusaureusinagriculturalproductsbymultiplexPCRmethod

2013-05-15发布2013-09-01实施

吉林省质量技术监督局发布

I

DB22/T1828—2013

前言

本标准按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2001给出的规则起草。本标准由吉林省质量技术监督局提出并归口。

本标准起草单位：吉林省产品质量监督检验院、吉林农业大学。

本标准主要起草人：邴炜、陈萍、史艳宇、李月红、任常菲、王秀娟、崔敬爱。

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DB22/T1828—2013

农产品中沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌的多重PCR检测

1范围

本标准规定了农产品中沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌核酸的多重PCR检测方法。本标准适用于农产品中沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌的快速筛选检测。

本标准不适合仲裁检验。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB4789.4食品微生物学检验沙门氏菌检验GB4789.5食品微生物学检验志贺氏菌检验

GB4789.10食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB19489实验室生物安全通用要求

WS/T230临床诊断中聚合酶链式反应（PCR）技术的应用

3术语和定义

下列术语和定义适用于本标准。3.1

多重聚合酶链式反应（多重PCR）multiplepolymerasechainreaction

多重PCR又称多重引物PCR，是在同一PCR反应体系中加上两对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应。

4缩略语

下列缩略语适用于本标准。

invA基因：侵袭蛋白基因（invasionproteinAgene）

nuc基因：耐热核酸酶基因（thermo-stablenucleasegene）

ipaH基因：侵袭性质粒抗原基因（invasiveplasmidantigenHgene）5试剂

除特别说明以外，所用试剂为分析纯或生化试剂。

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DB22/T1828—2013

5.1水：应符合GB/T6682中一级水的规格。

5.2缓冲蛋白胨水（BPW）：按GB4789.4规定。

5.37.5%氯化钠增菌肉汤：按GB4789.10规定。

5.4志贺氏菌增菌肉汤-新生霉素：按GB4789.5规定。

5.5引物：见表1。

表1引物序列

致病菌名称

靶基因

上下游引物序列

产物长度/bp

终浓度/(mmol/L)

沙门氏菌

invA

5’-GTCATGATATTCCGCCCCATATT-3’

255

40

5’-CGGTGCGATGAAGTTTATCAAAG-3’

40

金黄色葡萄球菌

nuc

5’-GCTCAGCAAATGCATCACAAAC-3’

506

120

5’-AGCGTTGTCTTCCGCTCCAAA-3’

120

志贺氏菌

ipaH

5’-GTTCCTTGACCGCCTTTCCGATACCGTC-3’

620

80

5’-GCCGGTCAGCCACCCTCTGAGAGTAC-3’

80

5.6细菌基因组DNA提取试剂盒。

5.710×PCR缓冲液：200mmol/LTris-HCl（pH8.4），200mmol/L氯化钾，20mmol/L氯化镁。

5.8dNTP：dATP、dCTP、dGTP、dTTP。

5.9TaqDNA聚合酶。

5.10分子量标记：100bpDNAMarker。

5.11琼脂糖：电泳纯。

5.12溴化乙锭。

5.1350×TAE电泳缓冲液（储备液）：称取484gTris，量取114mL冰醋酸，200mL0.5mol/LEDTA，溶于水中，定容至