细胞生物学常用技术.pptxVIP

细胞生物学常用技术;2.应用

(1)条件

可检测、可摄入

(2)方法

放射自显影（autoradiography）

蛋白质-aa

DNA-T

RNA-U

脉冲标记;A放射性物质脉冲掺入活细胞

B不同时间取样切片

C暗处曝光

D显影、定影;胰岛素合成分泌过程;(二)抗体示踪技术

;2.抗体+电子致密物电子显微镜;六、细胞分子生物学技术

1.聚合酶链式反应

（polymerasechainreaction，PCR）

特异性体外DNA扩增技术

利用针对目的基因所设计的一对

特异寡核苷酸引物，以目的基因

为模板，以dNTP为原料，在DNA聚

合酶作用下进行的DNA体外合成技

术。;

（1）反应体系：模板链

DNA聚合酶

dNTP

引物（primer）

（与模板相应序列互补）

（2）反应步骤：

变性94℃

退火55℃

延伸72℃;2.RealtimePCR

实时定量PCR(荧光定量PCR)

通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号

的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分

析。;3.核酸分子杂交

(1)Southernblotting–DNA

将凝胶分离的DNA转移到固相支持膜上,然后与存

在于液相中的标记探针进行杂交,以检测特定DNA序

列的技术.

(2)Northernblotting–RNA

;A基因组DNA的消化

B琼脂糖凝胶电泳分离

C转膜

D杂交

E放射自显影;(3)原位杂交技术（insituhybridization）

用核酸探针与细菌、细胞或组织切片中的核酸进

行杂交，以检测特定核酸分子在细胞内原有位置

的方法。;4.基因转移技术

应用物理、化学或生物学等技术和方法将外源

基因转移到受体菌或细胞内，并使其在细胞内实

现转入基因的扩增或表达。

外源基因细菌转化

真核细胞转染

;(1)限制性核酸内切酶

限制性内切酶：识别DNA分子内

由4～8个碱基构成的特定序列

的酶，这些酶的识别位点大多

是“回文”序列。

粘性末端

平滑末端;(2)质粒载体克隆;(3)克隆基因的表达

在细菌中的表达;在动物细胞中的表达;5.抑制基因表达技术

研究基因功能及调控

疾病的防治

;起始阶段：

双链RNA导入细胞siRNA(21-23)

（shortinterferingRNAs）

效应阶段：

RNA诱导沉默复合物RISC解链结合mRNA

（RNAinducedsilencingcomplex）（降解）;6.免疫沉淀技术(immuno-precipitation,IP)

是利用抗原和抗体的特异性结合以及细菌的ProteinA或G特异性地结合到免疫球蛋白的Fc片段的现象而发展的可以研究蛋白质相互作用的方法。

研究蛋白质相互作用

基本过程

制备细胞裂解液

抗体-凝胶颗粒或磁珠孵育细胞裂解液

沉淀目的蛋白及相互作用蛋白

分析SDS

Westernblot

质谱;免疫沉淀过程;7.染色质免疫沉淀技术

(chromotinimmunoprecipitation,ChIP)

研究蛋白质与DNA相互作用的一种方法，即确定与特定蛋白结合的基因组区域或确定与特定基因组区域结合的蛋白质

基本过程

甲醛处理细胞

超声破碎染色质

加入目的蛋白的抗体，形成抗体-靶蛋

白-DNA复合物

沉淀复合物

分析DNA片段