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制备芯片的完整流程
1.ROUNDA
(1)逆转录反应合成第一链:(试剂用的是SuperII的)
阴性对照:水;阳性对照:HeLa细胞RNA(50ng)
在0.5mlEp管中,加入5ulRNA(病毒的)或1ulRNA(细胞的)及1ulprimerA(40mM,随
机引物)或特异性下游引物1ul,补水使终体积为10ul,65°C,5min,室温冷却5min,再
加入10uLof2Xenzymemix(事先配制好);配方如下:
2Xenzymemix
2.0ul10XRTBuffer
0.4ul25mMdNTPmix(finalconcentration500uMeachnucleotide)
3.6ulHO
2
2.0ul0.1MDTT
2.0ulReverseTranscriptase(SuperII)
42°C,30min;65°C5min;室温5min;
加入1uLRT
再进行:42°C,30min。
(2)用Sequenase合成第二链:
上面样品加热94°C2min,迅速冷却至10°C,并在10°C放置5min.
加入10uLSequenasemix(事先配制好)(配方见下),使RXN总体积为30uL
SequenaseMix
2.0ul5XSequenaseBuffer
7.7ulHO
2
0.3ulSequenase
缓慢从10°C加热至37°C,加热时间为8min以上;
然后37°C放置8min;迅速加热至94°C,并在94°C保持2min;
迅速冷却至10°C,并在10°C放置5min,放置期间加入1.2ul稀释后的Sequenase(1:4稀释)
缓慢从10°C加热至37°C,加热时间为8min以上;
然后37°C放置8min;迅速加热至94°C,并在94°C保持8min;
2.ROUNDB(PCR反应,试剂用的是Fermentas的)
RoundA模板6
25mMMgCl28
10XPCRBuffer10
25mMdNTP1(事先配好)
PrimerB(100pmol/ul)1
TaqPolymerase(hotstart)1
Water73(使总体积为100ul即可)
RoundBCycles:
30sec94°C
30sec40°C
30sec50°C
1min72°C
Run35cycles。
PCR结果在1%琼脂糖凝胶电泳,在500bp-1kb之间应当有一DNAsmear,要确保阴性对照中无
DNA条带。
3.ROUNDC
RoundB模板10100XmodifieddNTPmix配方
25mMMgCl28(注意浓度)25mMdATP
10XPCRBuffer1025mMdCTP
100XmodifieddNTPmix125mMdGTP
PrimerB(100pmol/ul)110mMdTTP
Taq115mMaa-dUTP
Water69或68(使总体积为100ul即可)以上各试剂浓度都是100mM
30sec94°C
30sec40°C
30sec50°C
1min72°C
20cycles
4.纯化aa-dUTP标记的cDNA
为继续后面aa-dUTP(氨基丙烯-dUTP)与Cy
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