葡萄酒中 4 种黄酮类物质的测定 高效液相色谱-质谱法.docx

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葡萄酒中4种黄酮类物质的测定高效液相色谱-质谱法

1范围

本文件规定了葡萄酒中4种黄酮类物质（槲皮素、烟花苷、芦丁、黄岑素）的高效液相色谱-串联质谱检测方法。

本文件适用葡萄酒中4种黄酮类物质的测定。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法

3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4原理

试样经80%甲醇溶液涡旋超声提取，取上清液，经分散固相萃取净化，用高效液相色谱-质谱联用仪检测，外标法定量。

5试剂和材料

本方法所用的试剂，除另有规定外，均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。

5.1试剂

5.1.1乙腈：色谱纯。5.1.2甲醇：色谱纯。5.1.3甲酸：色谱纯。

5.1.4十八烷基硅烷键合硅胶（C18）：40μm~60μm。5.1.5无水硫酸镁（MgSO4）粉末：粒径50μm。

5.1.6N-丙基乙二胺（PSA）粉末:粒径50μm。

5.1.70.1%甲酸溶液：取甲酸（5.1.3）1.0mL，用水定容到1000mL，摇匀。5.1.880%甲醇溶液：取甲醇（5.1.2）800mL，用水定容到1000mL，摇匀。

5.2标准品

4种黄酮类物质中英文通用名称、化学分子式和CAS号见附录表A。

5.3标准溶液配制

T/NAIAXXX—2025

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5.3.1标准储备液（1.0mg/mL）：分别准确称取4种黄酮类标准品10mg（准确至0.1mg），用甲醇（5.1.2）分别溶解并定容至10.0mL，于-18℃避光保存，有效期3个月。

5.3.2混合标准中间液（100.0μg/mL）：分别准确吸取标准储备液（5.3.1）1.0mL，用甲醇（5.1.2）溶解并定容至10.0mL，于-18℃避光保存，有效期1个月。

5.3.3基质混合标准工作溶液：分别准确吸取混合标准中间液（5.3.2）适量，用初始流动相配制成浓度为10.0ng/mL~500.0ng/mL的标准工作液，临用现配。

6仪器和设备

6.1高效液相色谱-串联质谱仪：配备电喷雾离子源(ESI)。

6.2分析天平：感量0.1mg和0.01g。6.3涡旋混合器。

6.4离心机：最大转速9000r/min。6.5超声波发生器。

6.6有机微孔滤膜，孔径0.22μm，或相当者。

7分析步骤

7.1试样制备

取代表性样品摇匀分装，密闭常温或冷藏保存。

7.2测定步骤

称取5g样品（精确至0.01g）于50mL离心管中，加入10mL80%甲醇溶液（5.1.8），涡旋震荡5min，8000r/min离心5min。移取上清液至装有50mgC18（5.1.4）、100mg无水MgSO4（5.1.5）和30mgPSA（5.1.6）的离心管中，涡旋混合2min，8000r/min离心5min，有机滤膜过滤后，供高效液相色谱-串联质谱仪测定。

7.3仪器参考条件

7.3.1液相色谱参考条件

a）色谱柱：C18，2.1mm×100mm，粒径3.5μm或性能相当者。

b）柱温：40℃。

c）流动相：A：0.1%甲酸溶液，B：乙腈；梯度洗脱见表1。

d）流速：0.3mL/min。e）进样量：10μL。

表1流动相及梯度洗脱条件

时间/min

流速/（mL/min）

流动相A/%

流动相B/%

0.00

0.3

95

5

1.00

0.3

95

5

5.00

0.3

50

50

T/NAIAXXX—2025

3

7.00

0.3

5

95

9.00

0.3

5

95

10.00

0.3

95

5

12.00

0.3

95

5

7.3.2质谱参考条件

a）离子源：电喷雾离子源（AJSESI）。

b）扫描方式：负离子扫描。

c）检测方式：多反应监测（MRM）。

d）鞘气温度：300℃。

e）鞘气流速：6L/min。f）雾化器压力：40psi。g）喷嘴电压：500V。

h）毛细管电压：3500V。

i）定性离子对、定量离子对、碎裂电压、碰撞能量等参数参见附录A。

7.4定量测定

根据试液中被测物含量情况，选定浓度相近的基质标准混合使用液，基质标准混合使用液和待测试液中被测物的响应值均应在仪器检测的线性范围内。基质标准混合使用液与试液等体积进样测定。标准溶液及试液均按7.3.1和7.3.2规定的条件进行测定，如果试液中与标准溶液相同的保留时间有峰出现，则对其进