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饲料中牛羊源性成分的定性检测

【摘要】目的：为防止疯牛病和痒病的传播。方法：研究提供了一种利用

从动物饲料中提取牛羊动物基因组DNA的方法，并依据牛、羊基因组DNA的

特异性序列片段，利用种属特异性的引物，通过PCR扩增这一特定的DNA序列，

通过电泳分离PCR产物，以长度的PCR产物作对照。结论：实现了对动物饲料

中牛、羊源成分的检测。

【关键词】动物饲料；牛、羊源性；PCR；琼脂糖电泳；凝胶电泳成像

疯牛病（BSE）是发生在成年牛的一种慢性进行性高致死性神经系统疾病，

属人兽共患病。自1985年在英国发现以来，现已波及30多个国家和地区。由疯

牛病引发的公共卫生问题、社会经济和政治问题已超过疯牛病本身。疯牛病以其

病原超强的抵抗力、传播方式的特殊性、超长的潜伏期和高致死性正在成为有史

以来对人类威胁最大的传染病之一。疯牛病主要通过食物链传播，是由于牛食用

了含有朊病毒的肉骨粉饲料所致，禁止含牛羊源性成分饲料的生产，流通，使用，

成为预防疯牛病感染，流行的主要手段之一。对饲料中牛羊源性成分的检测具有

重要的意义[2]。本方法的最低检出限为0.25%。

1仪器，试剂与样品

1.1仪器

1.1.1高压灭菌锅

1.1.2离心机（micromax型，美国Thermo公司）

1.1.3迷你旋涡混合器（minishaker）

1.1.4水浴锅

1.1.5PCR仪（T-GradientThermoblock，德国Biometra公司）

1.1.6电泳仪（PowerPaceuniversal，Biorad公司）

1.1.7凝胶电泳成像系统（GelDocXR型，Biorad公司）

1.2试剂[3]

除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，水为灭菌双蒸水。

1.2.1动物源性植

1.2.2物饲料基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）

1.2.3电泳缓冲液：称取54gTris，27.5g硼酸，20mLEDTA溶液，然后

用水定容到1L，使用时10倍

1.2.4稀释Tris：tris（hydroxymethyl）aminomethane，

1.2.5三（羟甲基）氨基甲烷，EDTA：ethylenediaminetetraaceticacid，

1.2.6乙二胺四乙酸。

1.2.710mg/mL溴化乙锭溶液

1.2.8琼脂糖电泳纯。

1.2.925umol/L引物溶液

1.2.10TaqDNA聚合酶（5U/μL）Taq：Thermusaquaticu，

1.2.11水生栖热菌

1.2.12各10mmol/L的四种脱氧核糖核甘酸混合液（dNTP：dATP、dTTP、

dCTP、dGTP）

1.2.13DNA分子量标

1.2.14记物100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp（大连宝生物）

1.3样品

从各地抽检的16种饲料做牛羊源性成分检测，同时作阳性对照，阴性对照，

空白对照。

阴性对照：不含牛或羊成分的饲料中提取的DNA作为PCR反应的DNA模

板；

阳性对照：含牛或羊成分的饲料中提取的DNA作为PCR反应体系的模板；

空白对照：用无菌重蒸馏水作为PCR反应体系的模板。

2方法

2.1饲料中牛羊DNA的提取

取50mg研磨粉碎的动物源性饲料于离心管，依所用试剂盒中的操作提取

DNA。如下：向管中加320μL缓冲液GA，振荡；加20μL（20mgml-1）蛋白酶，

混匀，65℃水浴30min；加340μL缓冲液GB，混匀，水浴10min；12000rmp离

心2min，取上清液400μL于新管，向上清中加200μL无水乙醇混匀，将其全部

加入一个吸附柱CB3中（有收集管），离心2min倒掉废液，放回收集管中；加

500μL去蛋白液GD离心30s，倒掉废液，将吸附柱放回。再用漂洗液PW700μL，