DB45T 2180-2020 甘蔗黄叶病毒检测技术规程.docxVIP

ICS65.020.20B16

DB45

广西壮族自治区地方标准

DB45/T2180—2020

甘蔗黄叶病毒检测技术规程

Technicalcriterionfordetectionofsugarcaneyellowleafvirus

2020-10-29发布2020-11-30实施

广西壮族自治区市场监督管理局发布

I

DB45/T2180—2020

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

本文件由广西壮族自治区糖业办公室提出并监督实施。

本文件由广西糖业标准化技术委员会归口。

本文件起草单位：广西壮族自治区农业科学院甘蔗研究所、广西甘蔗遗传改良重点实验室。本文件主要起草人员：魏春燕、覃振强、韦金菊、宋修鹏、张小秋、李德伟。

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DB45/T2180—2020

甘蔗黄叶病毒检测技术规程

1范围

本文件规定了甘蔗黄叶病毒检测技术规程的样品采集与存放，组织免疫印迹法检测和一步法RT-PCR检测的原理、仪器与设备、试剂、操作步骤和检测结果的判定。

本文件适用于甘蔗黄叶病毒的快速检测。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682—2008分析实验室用水规格和试验方法

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。3.1

+1叶topvisibledewlapleaf甘蔗植株最高可见肥厚带叶。

4样品的采集与存放

4.1采样工具

砍刀、剪刀、镊子等采样工具应经121℃±2℃、1.1×105Pa高压灭菌15min或经160℃干烤2h。4.2采样方法

4.2.1采样前和采样过程中应避免样本交叉污染，采样及样品前处理过程中应戴一次性手套。

4.2.2甘蔗植株采样：取甘蔗植株的+1叶，剪掉叶尾，从叶基部开始保留15cm长，编号保存备用。

4.2.3甘蔗蔗种采样：取中部种茎，编号保存备用。4.3运送和存放

4.3.1用于组织免疫印迹检测的样品采集后，用保温壶或保温桶加冰密封，在2℃~8℃条件下进行运送；运到实验室后应在4℃条件下保存，存放应不超过7d。

4.3.2用于一步法RT-PCR检测的样品采集后，用保温壶或保温桶加冰密封，在2℃~8℃条件下进行运送；运到实验室后在4℃条件下保存应不超过24h，若需长期保存应放置-80℃冰箱且避免反复冻融。

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DB45/T2180—2020

5组织免疫印迹法检测

5.1原理

将待测的样品印迹在固相载体硝酸纤维素膜上，用病毒的特异性抗体与吸附在固相载体上的病毒进行特异性反应，再与碱式磷酸酶标记的第二抗体进行反应，最后用碱式磷酸酶的反应底物硝基酚磷酸片进行显色反应，根据颜色的变化，确定病毒的感染程度。

5.2仪器与设备

5.2.1圆周式摇床：可调振荡速度50rpm～300rpm。

5.2.2普通光学显微镜：放大倍数范围40X～1600X。

5.2.3电子天平：感量0.1g。

5.2.4硝酸纤维膜、酒精灯、手术刀、载玻片、培养皿。5.3试剂

5.3.1除另有规定外，所用试剂均为分析纯或生化试剂；实验室用水符合GB/T6682的二级水指标，

其中涉及PCR的用水应符合一级水指标；所有试剂均用灭菌的容器分装，配制好的溶液均在4℃条件下保存。

5.3.2甘蔗黄叶病毒单克隆抗体。

5.3.3碱性磷酸酯酶标二抗。

5.3.4硝基酚磷酸片（BCIP/NBT）。

5.3.5TBS-T缓冲液（pH7.5）：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl）15.7g，氯化钠（NaCl）8.7g，吐温-20（Tween-20）5mL,用蒸馏水溶解并定容至1000mL，pH调到7.5后进行高温灭菌，冷却后保存备用。

5.3.62％脱脂奶粉的TBS-T封闭液：称取2g脱脂奶粉用100mLTBS-T缓冲液配制成2％脱脂奶粉的TBS