一种快速检测乙肝环状DNA的方法 .pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局

(12)发明专利说明书

(10)申请公布号CN107703197A

(43)申请公布日2018.02.16

(21)申请号CN201610643869.7

(22)申请日2016.08.08

(71)申请人西南医科大学附属中医医院

地址646000四川省泸州市龙马潭区春晖路16号

(72)发明人郭永灿涂植光赵朝辉王友强

(74)专利代理机构成都高远知识产权代理事务所(普通合伙)

代理人李高峡

(51)Int.CI

权利要求说明书说明书幅图

(54)发明名称

一种快速检测乙肝环状DNA的方

法

(57)摘要

本发明公开了一种快速检测乙肝环

状DNA的方法。本发明快测HBV

cccDNA的方法，步骤如下：Ⅰ、采用

HBVcccDNA特异性DNA分子探针磁性

纳米微球分离富集HBVcccDNA；Ⅱ、扩

增和纯化HBVcccDNA；Ⅲ、快测；其

中，HBVcccDNA特异性DNA分子探针

磁性纳米微球的制备的法如下：(1)采用化

学共沉淀的制备Fe

法律状态

法律状态公告日法律状态信息法律状态

权利要求说明书

1.一种检测HBVcccDNA的方法,其特征在于:步骤如下:

I、采用HBVcccDNA特异性DNA分子探针磁性纳米微球分离富集HBVcccDNA;

II、扩增和纯化HBVcccDNA;

III、检测;

其中,HBVcccDNA特异性DNA分子探针磁性纳米微球的制备方法如下:

(1)采用化学共沉淀的制备FeSub3/SubOSub4/Sub纳米粒子;

(2)采用反相乳液的制备硅壳磁性纳米颗粒;

(3)对硅壳磁性纳米颗粒进行亲和素修饰;

(4)偶联针对cccDNA特异序列的ssDNA探针。

2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述步骤(1)的方法如下:将

1.0mol/LFeClSub3/Sub溶液与2.0mol/L2/Sub溶液混合,FeClSub3/Sub

溶液与FeClSub2/Sub溶液的体积比为4:1,加入FeClSub2/Sub溶液25倍体

积的浓度为0.7mol/L的氨水溶液,离心,得黑褐色沉淀,用FeClSub2/Sub溶液15

倍体积的浓度为2.0mol/L的高氯酸溶液分散,水洗至中性,干燥,得

FeSub3/SubOSub4/Sub纳米粒子。

3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述步骤(2)的方法如下:将

Triton3/SubOSub4/Sub纳米粒子,搅拌均匀,然后加入正硅酸乙酯和氨水,持

续搅拌24h,反应结束后,用丙酮破坏乳化,收集颗粒,得硅壳磁性纳米颗粒。

4.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于:加入FeSub3/SubOSub4/Sub

纳米粒子溶液的浓度为5mmol/L,加入的量为TritonX-100、正己醇和环己烷混合溶

液体积的2/5;正硅酸乙酯和氨水的加入量分别为TritonX-100、正己醇和环己烷混

合溶液体积的20倍。

5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述步骤(3)的方法如下:将2.5mg/ml的链

霉亲和素溶液加入到硅壳磁性纳米颗粒中,在4°C下恒温振荡培育24h,用PBS缓冲

液洗涤颗粒3次,再加入2%的戊二醛溶液在室温下浸泡,得磁性纳米悬浊液。

6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述步骤(4)的方法如下:

1)纳米预处理:取磁性纳米颗粒混悬液,离心,弃上清,加入结合缓冲液,制成浓度为

1μg/μl的磁性微粒悬液,其中,结合缓冲液是Tris-HCl和NaCl的混合溶液,Tris-HCl

的浓度为20mmol/L,NaCl的浓度为150mmol/L;

2)探针预处理:将合成