下一代测序技术简介.pptVIP

NextGenerationSequencing(NGS)技术简介Sanger测序Sanger测序法仍然为基因测序行业内的金标准，但鸟枪测序法在技术上存在瓶颈。（价格昂贵、步骤繁琐、效率低）第三代测序：NGS=HTS,SingleMoleculeSequencing（高通量、单分子测序）第一代测序：SangerSequencing（Sanger测序）NGS=NextGenerationSequencingNGS也称为高通量测序High-throughputSequencing(HTS)第二代测序：NGS=MassivelyParallelSequencing（大规模平行测序）目前NGS的主要三种测序仪器三种测序仪在高通量水平、测序准确度、存储格式和技术方法上均有差异。三大测序平台的技术特点和差异罗氏/454基因组测序仪FLX系统焦磷酸测序法光学230-400在第二代中最高读长；比第一代的测序通量大样品制备较难；难于处理重复和同种碱基多聚区域；试剂冲洗带来错误累积；仪器昂贵illuminaHiSeq2000/miSeq可逆链终止物和合成测序法荧光/光学2x150很高测序通量仪器昂贵；用于数据删节和分析的费用很高ABI/SOLiD5500xlSOLiD系统连接测序法荧光/光学25-35很高测序通量；在广为接受的几种第二代平台中，所要拼接出人类基因组的试剂成本最低测序运行时间长；读长短，造成成本高，数据分析困难和基因组拼接困难；仪器昂贵公司平台名称测序方法检测方法大约读长(碱基数)优点相对局限性Roche454焦磷酸测序原理Roche454测序原理Roche454测序步骤样品处理主要是针对大片段的DNA分子，如基因组DNA、Fosmid或BAC质粒等，利用超声或氮气打断将这些DNA分子片段化，然后采用琼脂糖凝胶电泳回收或磁珠纯化，选择500-800bp的DNA片段。对于非编码RNA或PCR产物，则不需要这一步骤。一、样品处理Roche454测序步骤文库制备包括接头连接和磁珠纯化两步，454的文库接头分A、B两种，各44bp，由20bp的PCR引物、20bp的测序引物及4bp（TCAG）的“key”碱基构成，其中B接头的5’端带有生物素（Biotin）标记，用于磁珠纯化步骤。二、文库制备Roche454测序步骤三、连接微珠将富集到的文库与测序磁珠、各反应物混合，加入特定的矿物油和表面活性剂，再利用振荡器剧烈振荡，使反应体系形成油包水（water-in-oil）的稳定乳浊液。在理想条件下，每一个液滴，或称微反应器（microreactor）中将只包含一个磁珠和一条单链DNA，通过控制条件，1mL乳液中可以形成至少10的6次方个理想的微反应器。Roche454测序步骤emRCRPCR扩增后，每一个磁珠上将形成密集的DNA簇，这些DNA序列完全相同，即可用于后续的步骤。乳液PCR（emRCR）Roche454测序步骤反应板准备、上机测序454测序的反应板称为PTP（PicoTiterPlate），含有350万个由光纤组成的小孔，每个孔的直径为29μm，而测序磁珠的直径为20μm，因此每个孔中仅能容纳一个磁珠。Roche454测序步骤测序和分析将磁珠与测序试剂加入PTP中，使之可用于上机测序。在454测序仪中，A、T、G、C四种碱基是分别存储在单独的试剂瓶中的，每步反应四种碱基依次加入反应池，当碱基配对结合，就会释放出一个焦磷酸（PPi），而这个焦磷酸在酶的作用下，将荧光素氧化成氧化荧光素，并发出光信号，从而读取出这一位置的碱基信息。Illumina测序原理Illumina合成测序原理Illumina测序流程桥式PCR合成法测序数据读取ABISOLiD测序原理ABISOLiD连接测序原理ABISOLiD测序流程制备DNA文库乳液PCR/微珠富集连接酶测序:SOLiD连接反应的底物是8碱基单链荧光探针混合物。连接反应中，这些探针按照碱基互补规则与单链DNA模板链配对。这样经过五轮测序反应后便可以得到所有的碱基序列SOLID的双碱基编码矩阵ABISOLiD连接测序原理探针的5′末端标记了1种颜色的荧光染料。探针3′端1～5位为随机碱基，其中第1、2位构成的碱基对表征探针染料类型，而3～5位的“n”为随机碱基，6～8位的“z”是可以和任何碱基配对的特殊碱基。SOLiD测序反应的每一轮测序反应会连接第1~5位的碱基，同时切除第6~8位的碱基，同时记录下第1~2位碱基决定的荧光颜色。ABISO