友康 NK高性能版使用说明书2024.3.12.docx

Nkcellserum-freeculturekit5.0

NK细胞无血清培养套装高性能版

(接种血量50mL培养体系)

I使用说明交件

Instruction

Instructionmanual

使用前请仔细阅读本操

使用前请仔细阅读本操

友康生物科技(北京)股份有限公司

NK细胞无血清培养套装使用说明书——高性能版50mL血

【适用范围】

用于外周血或脐血体外诱导扩增NK细胞

【产品组成】

适用于50mL外周血或脐血的样本量,使用2~3L培养基

高性能版NK细胞无血清培养基

NC0102.F

NK细胞前期激活使用

1瓶,200mL/瓶

2~8℃

NK细胞无血清培养基

NCO102

NK细胞体外培养

2瓶,1L/瓶

2~8℃

NK细胞诱导扩增试剂盒(高性能版)

AN0104-2

YCOOA:起始培养时包被培养瓶使用

1支,500YL/支

YCOOB:起始培养时添加

1支,500YL/支

YCOOC:激活培养基添加

1支,200YL/支

YC005:扩增培养基添加

2支

庆大霉素:添加至培养基使用

1支,300YL/支

注意:

每次添加的培养基需提前取出放置培养箱中预温至37℃,禁止将整瓶培养基放置37℃反复预温。

【单个核细胞分离】1.试剂准备

分离单个核细胞前,应将外周血、PBS(生理盐水)和淋巴细胞分离液室温平衡至20℃。2.血浆提取(离心机型号ThermosT-40R)

(1)将外周血平均分装到50mL离心管中,于室温下700g离心15min(离心机升速8,降速4),取上层淡黄色血浆至新的50mL离心管中(下层红色液体用于提取单个核细胞),于水浴锅中56℃灭活30min。

时离心机的升降速均调至最高即可)

3.单个核细胞的分离

(1)外周血:取上一步血浆提取后得到的下层红色液体用生理盐水1:1稀释,混匀,备用。

脐带血:取上一步血浆提取后得到的下层红色液体用生理盐水1:2稀释,混匀,备用。

(2)另取2支新的50mL的离心管,根据稀释血液的体积,按照1:的比例将稀释血液缓慢加到淋巴细胞分离液上层。(如20mL稀释血液,需要20mL分离液)使血液和淋巴细胞分离液形成一个明显的分层,注意不要将稀释血液混入到淋巴细胞分离液中,室温700g离心30min。(离心机调节升速6,降速4)

(3)轻轻吸取单个核细胞(白膜层)并转移至新的50mL离心管内,加入等体积生理盐水,室温700g离心10min。弃上清,再次用40mL生理盐水清洗细胞,200g离心10min,弃上清。用预温至37℃的培养基重悬细胞,备用,同时取少量细胞悬液计数。(离心机升速均调节至9,降速9)

注意:脐带血单个核细胞计数前应使用红细胞裂解液裂解红细胞。

【试剂准备】

1.激活培养基(200mL):将一支室温融化的YCOOC(200PL)加入200mL高性能版NK细胞无血清培养基(货号:NC0102.F)中,混匀备用。

2.扩增培养基(2L):每支YC005用1mLNK细胞无血清培养基(货号:NC0102)溶解,以1:1000的比例添加至NK细胞无血清培养基(货号:NC0102)中,混匀备用。

注意:前5天必须使用激活培养基,不可使用扩增培养基。

【使用步骤】1.第。天

T75培养瓶包被:TC处理的T75瓶中加入10mLDPBS和1支YCOOA,充分混匀后,37℃孵育2h,弃去上清,并用10mLDPBS清洗一次,注意不要冲刷培养瓶底部,弃清洗液后备用。

PBMC接种:T75瓶中加入激活培养基、1支诱导因子YCOOB、10%比例的自体血浆(3mL)和单个核细胞,总体积30mL,外周血单个核细胞细胞密度2E6/mL,脐带血单个核细胞密度3E6/mL。

注意:因脐血单个核细胞中易掺入红细胞,计数结果常出现大的误差,这会导致接种密度出现偏差,应使用红细胞裂解液将红细胞裂解后再计数。

YCOOA包被2h仍无法接种细胞时,将含有YCOOA包被液的T75瓶转移到2~8℃冰箱保存、不要剧烈晃动,接种前取出清洗即可。2~8℃冰箱中可保存12h。

2.第3天

1:1比例补液,T75瓶中补加30mL激活培养基和5%的自体血浆(1.5mL),